非酒精性脂肪肝病(NAFLD)指日攝入酒精量小于10g而肝臟脂肪沉積大于肝臟總重5%的以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征,NAFLD包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、進展性肝纖維化和肝硬化等一系列肝臟損害的疾病譜。大部分非酒精性脂肪肝病患者長期停留在單純性脂肪肝的階段,也簡稱為“脂肪肝”。 近年來,隨著人們飲食結構、生活方式的改變,NAFLD的發(fā)病率大幅上升,全球普通人群中平均患病率約20%,肥胖及2型糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者中分別達60%和75%,現(xiàn)己成為危害人類健康最常見的肝病。在美國,NAFLD的發(fā)病率為24%,NAFLD現(xiàn)已成為西歐、美國、澳大利亞第一大慢性肝病以及肝酶異常的首要病因,而在亞洲國家NAFLD的發(fā)病率也逐漸增加。在過去的7-10年,我國發(fā)達地區(qū)成人脂肪肝患病率大概增加了近一倍,且成人脂肪肝患病率高達15%,其中絕大多數(shù)為NAFLD。 NAFLD和代謝綜合征關系密切,近年研究者逐漸認識到NAFLD是代謝綜合征的一個重要組成部分,是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn),和心血管發(fā)病密切相關。因此,NAFLD的高發(fā)病率及其與人類代謝和心血管的密切關系使其成為全球關注的醫(yī)學研究熱點。由于大部分非酒精性脂肪肝病患者長期停留在單純性脂肪肝的階段,大部分患者終生停留在單純性脂肪肝的階段,一部分患者經過10年以上的時間方逐漸進展為NASH的階段,故單純性脂肪肝和代謝綜合征的關系更為密切。對其發(fā)病的機制的了解將對代謝綜合征和心血管疾病的防治有重要意義并為可能的治療方向提供靶點。 飲食因素被認為是導致脂肪肝發(fā)生的重要的環(huán)境因素。各種不同的飲食因子可以對脂肪肝的發(fā)生發(fā)展起保護或促進作用。其中果糖對脂肪肝發(fā)生發(fā)展的影響尤為引人注意,果糖多量存在于軟飲料等食品中,隨著上世紀70年代高果糖玉米糖漿(HFCS)引入食品加工業(yè)后,果糖的人群攝入量逐年增高,特別是一些青少年以軟飲料代水引用。流行病學研究發(fā)現(xiàn)高果糖攝入與人群的超重、血脂異常、代謝綜合征發(fā)病相關,動物研究表明,高果糖飲食可致大鼠血脂異常、血糖增高、腹型肥胖及血壓升高,表現(xiàn)為較為典型的代謝綜合征,故而高果糖飲食的危害也逐漸被認識到。盡管報道不完全一致,人體和動物研究中都證明高果糖攝入有致脂肪肝的作用。大量動物研究報道高果糖飲食可誘導肝臟脂質沉積,短期和長期的高果糖喂養(yǎng)均可在嚙齒類動物引起脂肪肝。具體的機制尚不完全明確。根據(jù)既往的研究,慢性高果糖、高脂喂養(yǎng)后可誘導大鼠發(fā)生肝內脂質沉積和肝臟胰島素抵抗(IR)的發(fā)生,同時伴有各種肝細胞內各種事件的發(fā)生,如線粒體脂肪酸氧化功能障礙、脂質從頭合成增加、內質網應激、線粒體功能障礙等,但是脂肪肝發(fā)生的始動機制、各種肝內細胞事件的發(fā)生順序以及其與脂肪肝的發(fā)生的關系尚未闡明,同時,尚缺乏關于短期高果糖過量攝入對肝臟脂質沉積和肝胰島素敏感性的影響研究。 本研究首先觀察了短期(一周)高果糖喂養(yǎng)小鼠肝臟脂質含量的變化,在驗證了脂肪肝的形成后進一步評價了小鼠機體和肝臟的胰島素敏感性,并從功能和分子生物學上評價了早期脂肪肝形成時肝內線粒體脂肪酸氧化、脂質合成途徑;并通過檢測內質網應激相關因子的蛋白和基因的表達,觀察脂肪肝發(fā)生發(fā)展與內質網應激、炎癥通路的關系;同時,本研究以高脂飲食喂養(yǎng)作為對照的脂肪肝模型,探討不同飲食因素對小鼠肝臟的影響和可能的早期發(fā)生機制,從而對高果糖飲食的危害和脂肪肝的發(fā)生機制有進一步的了解(本研究于澳大利亞悉尼加爾文醫(yī)學研究所完成)。 第一部分短期高果糖、高脂喂養(yǎng)對小鼠肝臟甘油三酯及肝胰島素敏感性的影響 目的:探討短期高果糖、高脂飲食對肝臟脂肪沉積的作用及其對肝臟胰島素敏感性的改變。 方法:12-15周齡C57BL/J6小鼠106只(由澳大利亞Perth動物中心提供)。小鼠于溫度控制在22±1℃的動物飼養(yǎng)中心喂養(yǎng),室內光線為12小時白日/12小時黑夜循環(huán);適應性喂養(yǎng)一周后,隨機分為3組:對照組(Con)36只、高果糖組(HFru)35只、高脂組(HF)35只,對照組給予基礎飼料(standard lab chow diet,Gordon's Specialty Stock Feeds, Yanderra, Australia),熱量組成(見表1):碳水化合物71%,脂肪8%,,蛋白質21%,總熱量為260kcal/100g;高果糖組給予高果糖飲食,熱量組成:碳水化合物70%(其中果糖含35%),脂肪9%,,蛋白質21%,總熱量為260kcal/100g;高脂組給予高脂飼料,其熱量組成:碳水化合物20%,脂肪59 %,蛋白質21%,總熱量為540kcal/100g。為評估肝臟胰島素敏感性,于喂養(yǎng)后一周后每組隨機選8只小鼠,行腹膜下糖耐量試驗(ipGTT);另外每組隨機選取8只小鼠,于喂養(yǎng)一周末禁食10小時過夜,自小鼠尾部采血,應用低溫離心機離心后取血漿,用于測定空腹血胰島素(INS)及血漿TG。實驗結束后以斷頸法處死小鼠,立刻取出肝臟組織,迅速放入-70℃液氮中保存。將凍存肝組織勻漿,氮氣吹干,以GPO-PAP法測量TG含量。于喂養(yǎng)一周末每組隨機取12只小鼠,禁食10小時過夜,每組小鼠隨機選取6只小鼠注射生理鹽水,另向6只小鼠腹腔內注射含有葡萄糖(3g/kg BW)、胰島素(2U/kg.BW)的混合溶液,于注射后40分處死小鼠,其后留取肝臟組織,凍存于-70度。應用western blot方法測定前述胰島素葡萄糖混合溶液注射后40分鐘小鼠肝臟組織的蛋白激酶B (PKB/Akt,本文簡稱Akt)和糖原合成激酶-3α/β(GSK-3α/β)的總蛋白和磷酸化蛋白的表達。通過比較各組注射與未注射胰島素溶液的小鼠p-Akt/t- Akt(磷酸化Akt/總Akt)和p- GSK-3β/t- GSK-3β表達變化評估胰島素敏感性。 結果: 1各組小鼠體重及血生化指標的結果:不同飲食喂養(yǎng)一周后,各組小鼠間體重無明顯差異(p0.05);高果糖組和高脂組的單位體重附睪脂肪含量明顯高于對照組(P0.01)。各組間空腹血糖、胰島素和血漿游離脂肪酸、血漿甘油三酯(TG)無明顯差異(p0.05)。 2肝臟TG含量變化:與對照組相比,高果糖組和高脂組肝臟甘油三酯含量顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);其中高果糖組肝臟甘油三酯堆積較高脂組更顯著(P0.01)。 3腹膜下葡萄糖耐量實驗(ipGTT):與對照組相比,高果糖組和高脂組30′、60′、90′血糖顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01);與對照組相比,高果糖組和高脂組的葡萄糖曲線下面積顯著高于對照組(分別增加58%和64%),差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 4肝臟胰島素敏感性評估:與對照組相比,高果糖組和高脂組小鼠基礎狀態(tài)時p-Akt/t- Akt和p- GSK-3α/β/t- GSK-3α/β的比值無明顯差異(p0.05);胰島素注射40min后,與對照組相比,高果糖組和高脂組的p-Akt/t- Akt分別減少57%和42%(P均0.01),差異有統(tǒng)計學意義;高果糖組和高脂組的p- GSK-3α/β/t- GSK-3α/β的比值分別減少53%和52%(P均0.01),差異有統(tǒng)計學意義(P均0.01),提示高果糖組、高脂組小鼠的肝臟對胰島素敏感性減低,信號傳導減弱;胰島素注射后,高果糖組、高脂組兩組間p-Akt/t- Akt和p- GSK-3α/β/t- GSK-3α/β的比值無明顯差異(p0.05)。 結論: 1短期高果糖和高脂飲食喂養(yǎng)均可引起小鼠肝臟脂質沉積。 2短期高果糖和高脂飲食喂養(yǎng)均可引起小鼠糖耐量下降和肝臟IR發(fā)生。 3高果糖和高脂飲食喂養(yǎng)一周時,小鼠肝臟脂質沉積和肝IR并存。 第二部分短期高果糖、高脂喂養(yǎng)對小鼠肝臟內源性脂質合成代謝的影響 目的:從功能和分子水平兩方面全面的探討了短期高果糖、高脂飲食攝入時肝臟脂質從頭合成途徑的變化 方法:動物分組及標本取得同第一部分。從功能上,通過核素示蹤方法評估了肝臟內源性脂質從頭合成率,應用放射性3H標記H2O測定肝內源性脂質合成率。肝臟固醇調節(jié)元素結合蛋白(SREBP)、碳水化合物反應元件結合蛋白(ChREBP)的mRNA表達的測定采用實時熒光定量RT-PCR分析技術。應用Western-blot法分析肝臟脂質從頭合成關鍵酶------包括乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰CoA脫飽和酶-1(SCD-1)------的蛋白表達。 結果: 1各組小鼠肝細胞脂質從頭合成率比較:與對照組相比,高果糖組肝細胞脂質從頭合成率增加63% (p0.01),高脂組肝細胞脂質從頭合成率減少32% (p0.05),差異有統(tǒng)計學意義,提示高果糖喂養(yǎng)促進肝臟脂質合成,高脂喂養(yǎng)時肝臟脂質合成受抑制。 2各組小鼠肝臟SREBP和ChREBP基因表達比較:與對照組相比,高果糖組的肝內SREBP增加330%(p0.01),ChREBP基因表達增加44% (p0.05);高脂組的肝臟SREBP基因表達增加50%(p0.01),ChREBP基因表達無變化(p0.05)。3各組小鼠肝臟脂質從頭合成關鍵酶表達比較。與對照組相比,高果糖組肝臟FAS蛋白表達增加2.7倍(p0.01)、ACC蛋白表達增加6.4倍(p0.01)、SCD-1蛋白表達增加8.0倍(p0.01);相反,與對照組相比,高脂組ACC蛋白表達下降45%(p0.01)、SCD-1蛋白表達下降78%(p0.01)。 結論: 1高果糖飲食和高脂飲食對肝臟脂質從頭合成的影響相反;高果糖飲食使內源性脂質生成率增加,高脂飲食抑制肝內源性脂質生成率。 2短期高果糖飲食喂養(yǎng)明顯增加肝臟脂質合成酶類的上游轉錄因子SREBP和ChREBP的基因表達水平;短期高脂飲食喂養(yǎng)可增加肝臟SREBP的基因表達水平,但增加的程度明顯小于高果糖飲食;高脂飲食未明顯改變ChREBP的基因表達水平。 3高果糖飲食可明顯促進肝臟脂質合成酶類ACC、SCD-1和FAS的蛋白表達;而高脂飲食喂養(yǎng)時,肝臟脂質合成酶類ACC和SCD-1蛋白表達受抑制。 第三部分短期高果糖、高脂喂養(yǎng)食誘導脂肪肝的肝臟線粒體功能探討 目的:探討短期高果糖、高脂飲食致小鼠脂肪肝發(fā)生時肝臟內線粒體功能的改變。 方法:動物分組及標本取得同第一部分。從功能上,通過核素示蹤方法評估了肝臟線粒體底物氧化率測定,應用放射性[1-14C]標記的棕櫚酸(palmitate acid)測定肝細胞線粒體棕櫚酸氧化率;應用放射性[1-14C]標記的谷氨酸測定肝細胞線粒體谷氨酸氧化率。應用Western Blot方法測定線粒體生成和代謝等相關的標志蛋白——包括線粒體生成相關的上游因子增殖體活化受體共激活子-1α(PGC1α)、提示線粒體數(shù)量的蛋白電壓依賴性陽離子通道蛋白(VDAC)、線粒體脂肪酸氧化關鍵酶棕櫚基轉移酶Ⅰ(CPT-1)、以及線粒體呼吸鏈亞單位蛋白(ComplexI、II、III、V:應用一個可識別線粒體呼吸鏈的數(shù)個亞單位的WesternBlot雞尾酒抗體)和細胞色素氧化酶亞單位-1(COX-1(相當于ComplexIV))——的表達水平。 結果: 1各組小鼠肝細胞線粒體棕櫚酸氧化率:與對照組相比,高果糖組、高脂組的棕櫚酸氧化率無明顯增高或降低,差異無統(tǒng)計學意義(P均0.05)。 2各組小鼠肝細胞線粒體谷氨酸氧化率:與對照組相比,高果糖組、高脂組的谷氨酸氧化率無明顯增高或降低,差異無統(tǒng)計學意義(P均0.05)。 3各組小鼠肝細胞線粒體代謝標志蛋白表達比較:提示線粒體合成的蛋白PGC1-α在各組之間的蛋白表達無顯著差異(P0.05);提示線粒體數(shù)量的蛋白VDAC在各組之間的蛋白表達無顯著差異(P0.05);提示線粒體脂肪酸氧化代謝的CPT-1在各組之間的蛋白表達無顯著差異(P0.05)。 4各組小鼠肝細胞線粒體呼吸鏈蛋白表達比較:與對照組相比,高果糖組、高脂組的線粒體呼吸鏈亞單位蛋白ComplexI、ComplexII、ComplexIII、ComplexV的蛋白表達均無顯著差異,各組之間各線粒體呼吸鏈蛋白復合體表達無顯著差異(P0.05);另一提示線粒體代謝的蛋白COX-1在各組之間的蛋白表達無顯著差異(P0.05)。 結論: 1短期高果糖飲食和高脂飲食引起脂肪肝的同時,肝細胞內線粒體底物氧化功能無明顯減弱。 2短期高果糖飲食和高脂飲食引起脂肪肝的同時,線粒體生成和代謝相關標志蛋白包括PGC1α、VDCA、CPT-1、線粒體呼吸鏈線粒體呼吸鏈亞單位蛋白(ComplexI、II、III、V)和COX-1的蛋白表達均無明顯變化。 第四部分肝臟內質網應激(ERS)與高果糖、高脂飲食誘導脂肪肝的關系 目的:了解短期高果糖、高脂飲食喂養(yǎng)誘導脂肪肝發(fā)生時內質網的功能情況,從而探討不同飲食因素誘導脂肪肝的發(fā)生機制及其與內質網應激的關系。 方法:動物分組及標本取得同第一部分。應用Western Blot方法測定肝臟內內質網應激的標志物胰腺內質網激酶(PERK)、肌醇要求酶-1(IRE-1)、真核翻譯起始因子2α(eIF2α)的磷酸化蛋白表達;應用PCR(Polemerase Chain Reaction)方法測定X盒連接蛋白-1(XBP-1)的剪切形式XBP-1s的mRNA水平。 結果: 1與對照組相比,高果糖組的肝臟上游調節(jié)蛋白PERK的磷酸化蛋白(p-PERK)含量增加2.2倍(P0.01),其下游因子eIF-2α的磷酸化(p-eIF-2α/t-eIF-2α)亦增加2.6倍(P0.01);另一條通路的上游調節(jié)蛋白IRE-1的磷酸化(p- IRE-1 /t- IRE-1)增加2.1倍(P0.01),與之相應,下游的XBP-1的剪切形式XBP-1s的mRNA水平顯著增加1.15倍(P0.01),提示一周喂養(yǎng)時高果糖組小鼠存在肝臟內質網應激。 2與對照組相比,高脂組小鼠肝臟的p-PERK、p- eIF-2α/t-eIF-2α、p- IRE-1 /t- IRE-1的蛋白表達無明顯變化(P均0.05),XBP-1s的mRNA水平也沒有明顯變化(P0.05),提示一周喂養(yǎng)時高脂組小鼠無肝臟內質網應激。 結論: 1高果糖飲食在短期內誘導出小鼠脂肪肝和肝IR的同時,小鼠肝臟出現(xiàn)內質網應激,ERS可能介導了小鼠脂肪肝和肝IR的發(fā)生。 2高果糖飲食和高脂飲食對內源性脂質合成和內質網應激的相反影響提示ERS和脂質合成密切相關,具體因果關系尚待進一步研究。 3短期高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪肝和IR早于ERS發(fā)生,提示ERS不是高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪肝和肝IR發(fā)生的始動機制。 第五部分短期高果糖、高脂飲食喂養(yǎng)誘導脂肪肝的炎癥因子變化 目的:了解高果糖、高脂飲食誘導脂肪肝早期出現(xiàn)時炎癥通路的變化,從而進一步探討不同飲食因素誘導脂肪肝的發(fā)生機制及其與肝IR的關系。 方法:動物分組及標本取得同第一部分。應用Western Blot方法測定小鼠肝臟內兩條主要炎癥通路c-Jun氨基末端激酶(JNK)途徑和I kappa B激酶α/β(IKK-α/β)-核因子κB (NF-κB)途徑的蛋白表達變化(由于NF-κB蛋白檢測不穩(wěn)定,本實驗選取了p-IKK-α/β和t-IκB　)作為反應這條通路的指標。 結果: 1與對照組相比,高果糖組小鼠肝臟的p-JNK/tJNK、p -IKK-α/β/t- IKK-α/β和t-IKB　的蛋白表達無明顯變化(P均0.05)。 2與對照組相比,高脂組小鼠肝臟的磷酸化JNK增加(p-JNK/tJNK)2.0倍( p0.01),提示高脂喂養(yǎng)小鼠JNK通路激活;與對照組相比,高脂組的磷酸化IKK-α/β(p -IKK-α/β/t- IKK-α/β)和t-IκB蛋白含量均無明顯變化(p均0.05)。 結論: 1短期高果糖喂養(yǎng)出現(xiàn)的脂肪肝和IR不伴有肝內炎癥通路JNK通路和IKK-α/β通路的激活。2短期高脂喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)脂肪肝和IR的同時,肝臟內JNK通路激活,JNK通路可能介導高脂喂養(yǎng)小鼠的肝IR;IKK-α/β通路無變化。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R575.5
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮寫
引言
第一部分 短期高果糖、高脂喂養(yǎng)對小鼠肝臟甘油三酯及肝胰島素敏感性的影響
    前言
    材料與方法
    結果
    附圖
    附表
    討論
    小結
    參考文獻
第二部分 短期高果糖、高脂喂養(yǎng)對小鼠肝臟內源性脂質合成代謝的影響
    前言
    材料與方法
    結果
    附圖
    附表
    討論
    小結
    參考文獻
第三部分 短期高果糖、高脂喂養(yǎng)誘導脂肪肝的肝臟線粒體功能探討
    前言
    材料與方法
    結果
    附圖
    附表
    討論
    小結
    參考文獻
第四部分 肝臟內質網應激與高果糖、高脂飲食誘導脂肪肝的關系
    前言
    材料與方法
    結果
    附圖
    附表
    討論
    小結
    參考文獻
第五部分 高果糖、高脂飲食誘導脂肪肝的炎癥因子的變化
    前言
    材料與方法
    結果
    附圖
    附表
    討論
    小結
    參考文獻
結論
綜述一 非酒精性脂肪肝病肝外及肝內發(fā)病機制
    參考文獻
綜述二 高果糖飲食及其與代謝綜合征的關系
    參考文獻
致謝
個人簡歷

【共引文獻】

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本文編號：2844754