目的:建立小鼠慢性束縛應激(chronic restraint stress,CRS)模型,分析實驗組與對照組小鼠食管黏膜的變化和局部蛋白酶活化受體2(protei nase-activated receptor-2,PAR-2)、瞬時電位香草酸亞型 1(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV-1)及活性氧自由基(ROS)的表達水平及意義,探討心理應激在胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)食管高敏感性及食管炎癥發(fā)生中的作用,以及氧化應激所產(chǎn)生的影響。方法:20只雄性無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)昆明小鼠隨機分2組,即慢性束縛應激組(CRS)和正常對照組(normal control,NC)。CRS組小鼠每天在自制式束縛器中限制活動2h,其余時間兩組小鼠在相同環(huán)境中自由飲水攝食,實驗持續(xù)14天。通過HE染色在光學顯微鏡下觀察食管組織病理學改變并進行組織損傷評分。采用免疫組化方法檢測PAR-2,TRPV-1及還原型煙酰胺腺嗓吟二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NADPH oxidase 4,NOX-4)在小鼠食管中的表達,進一步通過蛋白質印跡法檢測PAR-2,TRPV-1蛋白表達量,并采用逆轉錄PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法檢測食管組織中 PAR-2、TRPV-1、氧化蛋白、抗氧化蛋白及相關炎癥因子微RNA的表達量。結果:與NC組小鼠相比,CRS組小鼠體重增加量低于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。HE染色鏡下觀察可見:CRS組小鼠食管黏膜可見上皮層增生,中性粒細胞及漿細胞浸潤等炎癥性改變,NC組未見明顯異常;此外CRS組小鼠上皮細胞損傷及黏膜下炎癥細胞評分均高于NC組,兩組差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05);NC組與CRS組黏膜下水腫評分差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫組化結果顯示,PAR-2和TRPV-1陽性著色細胞在大部分標本中均可見到,但CRS組小鼠組織中陽性著色較NC組染色深且豐富。蛋白質印跡法檢測結果表明,CRS組食管標本中PAR-2和TRPV-1蛋白質表達量顯著高于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.001)。實時定量RT-PCR實驗結果表明,CRS組PAR-2,TRPV-1和氧化蛋白NOX-4 mRNA表達水平高于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.001);與NC組比較,CRS組抗氧化蛋白錳超氧化物歧化酶(Mn-Superoxide dismutase,Mn-SOD)和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu Zn-SOD)mRNA表達水平明顯高于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05);CRS組炎癥相關因子,如白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素8(IL-8)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA表達水平較NC組顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(均P0.001)。結論:(1)PAR-2、TRPV-1受體在慢性束縛應激小鼠食管中過度表達,提示慢性束縛應激引起食管高敏感性的產(chǎn)生;(2)慢性束縛應激小鼠食管ROS(Nox-4)及抗氧化酶(Mn-SOD、CuZn-SOD)異常表達,提示慢性束縛應激誘導食管ROS過量產(chǎn)生,并引起食管氧化、抗氧化防御系統(tǒng)紊亂,導致氧化應激的產(chǎn)生;(3)心理應激誘導的氧化應激的發(fā)生可能參與食管高敏感性的產(chǎn)生。
【學位單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R571
【部分圖文】：

ａｎｄ?ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ?ｓｔａｔｅ?ｉｎ?ａ?ｍｕｒｉｎｅ?ｍｏｄｅｌ．?Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．?２０１６；７３：１８６－９５．）?〇??自制式束縛器是采用５０ｍｌ離心管用燒紅的探針將針筒的前壁及側壁布滿小孔（孔徑：??２－３ｍｍ，圖１），以減少塑料管內(nèi)溫度升高、保證使小鼠正常呼吸，并每五個束縛器??固定于平整的泡沫板上。到規(guī)定的束縛時間后應激組小鼠放置于束縛器，關閉離心??管口限制其活動，實驗持續(xù)１４天。實驗期間每７ｄ更換墊料１次，實驗一開始給予??足量水（４００ｍＬ）及飼料（１５０ｇ），之后每２天一次進行體重、飲水、飲食量。對照??組除不進行束縛以外，其它處理都相同（圖２）。??■?＿５??圖１自制式束縛器??Ｆｉｇ．２?Ｈｏｍｅ－ｍａｄｅ?ｒｅｓｔｒａｉｎｔ?ｄｅｖｉｓｅ??ａ?口涵醒??圖２造模過程??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｕｒｉｎｅ?ｍｏｄｅｌ??２．２．３造模成功評價??在慢性束縛應激的１４天下午開始對各組小鼠禁食水。束縛應激結束后，于第１５??天對各組小鼠進行深度麻醉（１０％水合氯醛，０．１ｍｌ／２０ｇ，?ｉ．ｐ．），采取平臥位固定，??腹部取正中切口約３ｃｍ，下腔靜脈取血，取靜脈血約１．５ｍｌ置于２ｍｌＥＰ管內(nèi)。血漿??樣品在取材后立刻以３５００ｒｐｍ的速度低溫離心５分鐘、留取上層血清、－８０°Ｃ保存

管口限制其活動，實驗持續(xù)１４天。實驗期間每７ｄ更換墊料１次，實驗一開始給予??足量水（４００ｍＬ）及飼料（１５０ｇ），之后每２天一次進行體重、飲水、飲食量。對照??組除不進行束縛以外，其它處理都相同（圖２）。??■?＿５??圖１自制式束縛器??Ｆｉｇ．２?Ｈｏｍｅ－ｍａｄｅ?ｒｅｓｔｒａｉｎｔ?ｄｅｖｉｓｅ??ａ?口涵醒??圖２造模過程??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｕｒｉｎｅ?ｍｏｄｅｌ??２．２．３造模成功評價??在慢性束縛應激的１４天下午開始對各組小鼠禁食水。束縛應激結束后，于第１５??天對各組小鼠進行深度麻醉（１０％水合氯醛，０．１ｍｌ／２０ｇ，?ｉ．ｐ．），采取平臥位固定，??腹部取正中切口約３ｃｍ，下腔靜脈取血，取靜脈血約１．５ｍｌ置于２ｍｌＥＰ管內(nèi)。血漿??樣品在取材后立刻以３５００ｒｐｍ的速度低溫離心５分鐘、留取上層血清、－８０°Ｃ保存，??并且分兩份使用。一份用于后續(xù)ＥＬＩＳＡ檢測ＡＣＴＨ?（促腎上腺皮質激素）、Ｃｏｒｔｉｓｏｌ??９??

圖３技術路線圖??Ｆｉｇ．３?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏａｄｍａｐ??
【參考文獻】

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本文編號：2844260