背景: 肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell ,HSC)受各種細(xì)胞因子的激活及轉(zhuǎn)化是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。通過阻斷細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),來抑制HSC的激活、增殖,誘導(dǎo)活化的HSC凋亡,成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要手段。瘦素是近年研究發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要促肝纖維化因子,它主要通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活HSC,促進(jìn)HSC增殖并抑制其凋亡,調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase -1,TIMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1 ,MMP-1)等的表達(dá),引起肝纖維化。 我們的前期體外研究發(fā)現(xiàn)熊果酸能抑制HSC增殖和誘導(dǎo)其凋亡;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熊果酸能減輕DMN引起的大鼠肝纖維化,效果優(yōu)于秋水仙堿;近期體外研究發(fā)現(xiàn),熊果酸干預(yù)后能明顯抑制NOX亞基Rac1和p22Phox的mRNA表達(dá)及ROS的產(chǎn)生,且能抑制核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)激活,從而誘導(dǎo)HSC凋亡。本研究將在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞TIMP-1、MMP-1mRNA表達(dá)及JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,探討熊果酸抗肝纖維化的分子機(jī)制。 目的: 觀察熊果酸對HSC-T6細(xì)胞TIMP-1mRNA、MMP-1mRNA表達(dá)的影響;觀察熊果酸對瘦素誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及JAK2-STAT3活化的影響,探討熊果酸抗肝纖維化的分子機(jī)制。 方法: 取對數(shù)生長期的肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)進(jìn)行隨機(jī)分組:瘦素組(100 ng/ml),熊果酸(50uM)干預(yù)組、NAC(10mM)干預(yù)組、DPI(20uM)干預(yù)組、AG490(50uM)干預(yù)組、熊果酸(50uM)自身對照組和正常對照組。在藥物分別作用HSC 6h、12h、24h后,提取總RNA,采用RT-PCR法檢測TIMP-1mRNA、MMP-1mRNA的表達(dá);藥物作用1h后采用熒光顯微鏡檢測肝星狀細(xì)胞內(nèi)ROS水平;藥物作用24h后采用免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)檢測HCS-T6中p-JAK2,p-STAT3蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1、熊果酸對HSC-T6細(xì)胞TIMP-1mRNA表達(dá)的影響 瘦素組6h TIMP-1mRNA的表達(dá)與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但作用12h、24h后的TIMP-1mRNA表達(dá)較正常對照組升高(均P0.05);熊果酸干預(yù)組12h、24h的TIMP-1mRNA表達(dá)明顯低于瘦素組(均P0.01),與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NAC干預(yù)組、DPI干預(yù)組、AG490干預(yù)組12h、24h TIMP-1mRNA的表達(dá)也低于瘦素組(P0.01或P0.05),熊果酸干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)與NAC干預(yù)組、DPI干預(yù)組、AG490干預(yù)組間相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);熊果酸自身對照組各時(shí)間點(diǎn)與正常對照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 2、熊果酸對HSC-T6細(xì)胞MMP-1mRNA表達(dá)的影響 瘦素作用HSC-T6細(xì)胞6h、12h、24h的MMP-1mRNA的表達(dá)較正常對照組明顯降低(P0.05或P0.01);熊果酸干預(yù)組6h、12、24h MMP-1mRNA的表達(dá)較瘦素組明顯升高(均P0.01),與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);熊果酸干預(yù)組在24h的MMP-1mRNA表達(dá)高于NAC干預(yù)組的表達(dá)(P0.05),在各時(shí)間點(diǎn)與DPI干預(yù)組、AG490干預(yù)組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);熊果酸自身對照組在各時(shí)間點(diǎn)與正常對照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3、熊果酸對瘦素誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響 瘦素作用HSC-T6細(xì)胞1h后DCF熒光強(qiáng)度較正常對照組明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);熊果酸干預(yù)組的DCF熒光強(qiáng)度較瘦素組明顯降低(P0.01);NAC干預(yù)組、DPI干預(yù)組和AG490干預(yù)組的DCF熒光強(qiáng)度也低于瘦素組(均P0.01);但熊果酸干預(yù)組的DCF熒光強(qiáng)度低于NAC干預(yù)組(P0.01),與DPI干預(yù)組和AG490干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),熊果酸自身對照組的DCF熒光強(qiáng)度稍高于正常對照組(P0.05)。 4、熊果酸對對HSC-T6細(xì)胞漿內(nèi)p-JAK2蛋白表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)分析發(fā)現(xiàn), HSC-T6細(xì)胞瘦素作用后胞漿表達(dá)p-JAK2蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,與正常對照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);熊果酸干預(yù)組、NAC干預(yù)組和DPI干預(yù)組的p-JAK2蛋白表達(dá)低于瘦素組(P0.05或P0.01),但高于正常對照組的表達(dá)水平(均P0.01);AG490干預(yù)組的p-JAK2蛋白表達(dá)顯著低于瘦素組(P0.01),而且低于正常對照組的表達(dá)水平(P0.05),熊果酸自身對照組的p-JAK2蛋白表達(dá)低于正常對照組(q P0.01)。 5、熊果酸對HSC-T6細(xì)胞核內(nèi)p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)分析發(fā)現(xiàn),HSC-T6細(xì)胞瘦素處理過后細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)p-STAT3蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,與正常對照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);熊果酸干預(yù)組的p-STAT3蛋白表達(dá)顯著低于瘦素組(P0.01),與正常對照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NAC干預(yù)組和DPI干預(yù)組的p-STAT3蛋白表達(dá)也低于瘦素組(P0.01),但高于正常對照組的表達(dá)水平(均P0.01);AG490干預(yù)組的p-STAT3蛋白表達(dá)顯著低于瘦素組(P0.01),與正常對照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值= 1.80,P0.05);熊果酸干預(yù)組的p-STAT3蛋白表達(dá)低于NAC干預(yù)組和DPI干預(yù)組(P0.05),與AG490干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);熊果酸自身對照組的p-STAT3蛋白表達(dá)與正常對照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論: 1.熊果酸可以下調(diào)TIMP-1mRNA的表達(dá)、上調(diào)MMP-1mRNA的表達(dá)。 2.瘦素能誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,生成的ROS可能參與了JAK2-STAT3的活化,熊果酸干預(yù)能抑制瘦素誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。 3.瘦素可以激活HSC-T6細(xì)胞內(nèi)的JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,熊果酸的干預(yù)能抑制瘦素誘導(dǎo)的JAK2-STAT3活化。 4.熊果酸對TIMP-1 mRNA及MMP-1 mRNA的表達(dá)的調(diào)控可能與抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,從而抑制JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

～G組6hTIMP-1mRNA和β-actinmRNA的表達(dá)

～G組12hTIMP-1mRNA和β-actinmRNA的表達(dá)

～G組24hTIMP-1mRNA和β-actinmRNA的表達(dá)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 戴穎;朱萱;;熊果酸抗實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化作用機(jī)制的研究[J];江西醫(yī)藥;2008年05期

2 歐陽燦暉;朱萱;張焜和;戴穎;陳江;何文華;李博;李弼民;;熊果酸對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA表達(dá)的影響[J];世界華人消化雜志;2009年22期

3 陳小亮;李俊;鄧子煜;金涌;呂雄文;李為;;苦參素對肝纖維化大鼠肝臟TGF-β1的調(diào)節(jié)作用[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2009年06期

本文編號：2843523