目的探討骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM MSCs)在體外淋巴細胞參與下對乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)復(fù)制的影響及其機制的初步研究。方法(1)選用體重80-100g BN大鼠,應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)/貼壁分離篩選法,分離、培養(yǎng)并擴增BM MSCs,應(yīng)用流式細胞術(shù)對所培養(yǎng)的第3代細胞進行表面標記分子鑒定,并通過誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為脂肪、成骨細胞,檢測BM MSCs的分化能力。(2)細胞共培養(yǎng):選取狀態(tài)良好的第三代BM MSCs,提取BN大鼠新鮮的脾淋巴細胞,選擇培養(yǎng)狀態(tài)良好的Hep G 2.2.15細胞,采用Transwell小室做細胞共培養(yǎng)。實驗分組:共5組,第1組為單純脾淋巴細胞組;第2組為單純Hep G 2.2.15細胞組;第3組為BM MSCs+Hep G2.2.15細胞組;第4組為脾淋巴細胞+Hep G2.2.15細胞組;第5組為脾淋巴細胞+BM MSCs+Hep G 2.2.15細胞組。(3)在共培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后,采用MTT法對脾淋巴細胞及貼壁細胞進行細胞活性檢測,實時定量PCR測定上清液中HBV DNA水平、Hep G 2.2.15細胞內(nèi)HBV ccc DNA水平及BM MSCs中的HBV ccc DNA水平,流式細胞術(shù)對T淋巴細胞亞群的比例變化進行檢測,應(yīng)用ELISA法檢測上清液中細胞因子IFN-γ、IL-10水平。結(jié)果(1)BM MSCs鑒定:在體外成功提取并擴增BM MSCs,對所提取的細胞進行鑒定,其具備典型的MSCs的形態(tài)特點,培養(yǎng)到第3代細胞進行表面標記分子學(xué)鑒定,結(jié)果顯示:CD29、CD90、RT1A表達的陽性率分別為97.0%、96.3%和96.3%,而CD34、CD45、RT1B陰性率均95%,且經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)分化后,所提細胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)能夠成功分化為成骨細胞(經(jīng)由von kossa染色后在顯微鏡下可以觀察到黑色鈣鹽沉積)及脂肪細胞(經(jīng)由油紅O染色后顯微鏡下可觀察到細胞胞漿內(nèi)呈紅色脂滴)。(2)檢測BM MSCs對HBV復(fù)制的影響:在體外細胞培養(yǎng)的環(huán)境下HBV DNA及HBV ccc DNA在24 h、48 h及72 h時,與第2、3和4組比較,第5組HBV DNA的表達水平明顯降低,且在48h時差異顯著,HBV DNA:(181.000±14.731)IU/m L vs(6270.000±300.450)IU/m L、(2564.000±231.058)IU/m L、(2433.300±302.379)IU/m L;HBV ccc DNA:(4.330×105±0.464×105)IU/m L vs(11.100×105±0.375×105)IU/m L、(8.930×105±0.778×105)IU/m L、(9.850×105±0.810×105)IU/m L,P0.01;各組BM MSCs中均未檢測出HBV ccc DNA的復(fù)制。(3)BM MSCs對HBV復(fù)制影響機制:細胞因子檢測結(jié)果,上清中淋巴細胞及BM MSCs分泌IFN-γ的水平與HBV DNA水平呈負相關(guān)(淋巴細胞24 h:r=-0.900;48 h:r=-0.982;72 h:r=-0.968,P0.05。BM MSCs 24 h:r=-0.828;48 h:r=-0.922;72 h,r=-0.828,P0.05),而IL-10水平與HBV DNA水平呈正相關(guān)(24 h:r=0.860,48 h:r=0.972,P0.05)。T細胞亞群檢測,結(jié)果顯示CD4+/CD8+比例有所升高,且經(jīng)相關(guān)性分析,共培養(yǎng)后淋巴細胞表面標志CD8+細胞的百分率與HBV DNA水平呈正相關(guān)(24 h:r=0.865,48 h:r=0.766,72 h:r=0.912,P0.05)。結(jié)論成功從BN大鼠股骨、脛骨中提取BM MSCs,并于體外培養(yǎng),通過細胞形態(tài)、細胞表面分子標記以及誘導(dǎo)分化能力這三方面進行驗證,符合BM MSCs的典型特征,在淋巴細胞參與下可以抑制HBV DNA的表達;影響HBV的復(fù)制,可能的影響機制是BM MSCs通過自身分泌IFN-γ等細胞因子,及通過調(diào)節(jié)Tc1/Tc2平衡等方式實現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

von Kossa試劑盒在誘導(dǎo)12-14 d后進行染色，如在顯微鏡下能夠觀察到細胞中有黑色的鈣鹽沉積則為陽性。1.2 結(jié)果1.2.1 BM MSCs 典型形態(tài)細胞形態(tài)學(xué)：提取、分離后剛接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞在顯微鏡下觀察呈圓形小亮點，形態(tài)大小均一、胞體透亮。48 h后觀察可見大部分細胞散在分布并貼壁生長，細胞形態(tài)以圓形為主，部分可見已伸展出偽足。隨著細胞培養(yǎng)液的更換，貼壁細胞逐漸分裂增殖、體積增大，形成多角形、梭形、橢圓形或紡錘形。培養(yǎng)7-8 d后出現(xiàn)明顯細胞集落，鋪滿培養(yǎng)瓶底大于80%，此時即可進行第1次傳代。隨后根據(jù)細胞生長情況約每3-4 d即可進行下一次傳代。雜質(zhì)細胞會隨每一次細胞傳代和換液逐漸越少，使細胞得以純化，逐漸變?yōu)榻^大部分為細長梭形且排列整齊、形態(tài)均一的細胞（圖1）。

對所獲細胞繼續(xù)進行了表面標記分子表達率的檢測。結(jié)果顯示第 3 代 BN 大鼠BM MSCs 表達 CD29、CD90、RT1A 的陽性率分別為 97.0%、96.3%和 96.3%；而 CD34、CD45、RT1B 的陰性率均>95%（圖 2），這樣的結(jié)果符合 BM MSCs表面標記分子的特征，即可證實我們所提取、培養(yǎng)的細胞是 BM MSCs。

圖 2. 大鼠 BM MSCs 表面標記鑒定A：CD29 CD34 的表達 B：CD45 CD90 的表達 C：RT1A RT1B 的表達1.2.3 BM MSCs 體外誘導(dǎo)分化能力檢測BM MSC 具備向多種組織及細胞的定向分化能力，給予特定培養(yǎng)條件，可將其誘導(dǎo)分化為脂肪和成骨細胞。所獲細胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化液培養(yǎng) 8-10 d 后，油紅 O 染液染色鏡下觀察示：與未經(jīng)誘導(dǎo)分化的細胞（圖 3-A）相比，其胞漿中可見多個被染成橘紅色的脂滴（圖 3-B），表明所獲細胞具備分化成為脂肪細胞的能力。同樣，細胞經(jīng)成骨細胞誘導(dǎo)分化液培養(yǎng)約 14 d 后，von Kossa 法染色顯微鏡下示：細胞可見被染成黑色的鈣鹽沉積物（圖 3-C），表明其具備分化為成骨細胞的能力。
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本文編號：2843162