APOBEC3G(載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣3G)是一種RNA/DNA編輯酶,具有胞苷脫氨酶活性,可使胞嘧啶(C)脫氨基變?yōu)槟蜞奏?U),從而誘導(dǎo)病毒基因組發(fā)生堿基突變,導(dǎo)致病毒整個復(fù)制周期終止,具有很強的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性。研究證實：APOBEC3G能抑制vif缺陷人類免疫缺陷病毒(HIV)-1及乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制。然而,APOBEC3G抑制HBV復(fù)制的具體作用機(jī)制,APOBEC3G基因在人體細(xì)胞中的其它生物學(xué)功能及其作用機(jī)制尚不清楚。另外,正常情況下,由于肝細(xì)胞不表達(dá)APOBEC3G或表達(dá)量相對很低,因此在HBV感染過程中,不同臨床轉(zhuǎn)歸類型的慢性HBV感染患者之間,外周血及肝細(xì)胞中APOBEC3G表達(dá)是否會存在差異,APOBEC3G是否在慢性HBV感染患者機(jī)體內(nèi)發(fā)揮了抗HBV作用,目前也不清楚�；谏鲜鲅芯勘尘�,本研究首先構(gòu)建表達(dá)APOBEC3G蛋白的重組真核表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞中,在體外初步探討APOBEC3G對HBV復(fù)制表達(dá)的影響,觀察HepG2.2.15細(xì)胞在高表達(dá)APOBEC3G后,APOBEC3G對細(xì)胞生長遷移能力、細(xì)胞周期和凋亡現(xiàn)象等生物學(xué)行為的影響。接著,觀察APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染類型(慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相關(guān)性肝癌)患者的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)及肝組織中的表達(dá)水平及其細(xì)胞內(nèi)定位。最后,通過體內(nèi)外實驗探討Janus激酶-信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)是否參與了APOBEC3G基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),以及慢性乙型肝炎(CHB)患者發(fā)生干擾素抵抗的分子機(jī)制。 (1)APOBEC3G基因?qū)epG2.2.15細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：應(yīng)用RT-PCR法從人PBMC中擴(kuò)增APOBEC3G基因,分子克隆法構(gòu)建表達(dá)APOBEC3G蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-APOBEC3G,并應(yīng)用脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-APOBEC3G轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞中,Western-blot鑒定細(xì)胞中APOBEC3G蛋白的表達(dá)。ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg水平,實時定量PCR檢測HBV DNA和HBV mRNA水平。應(yīng)用有限稀釋法篩選出高表達(dá)APOBEC3G的HepG2.2.15細(xì)胞,并通過Western-blot鑒定。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡；應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞株生長能力；應(yīng)用劃痕法觀察細(xì)胞遷徙運動能力。結(jié)果顯示：酶切鑒定證實APOBEC3G真核表達(dá)載體被成功構(gòu)建,Western-blot證實APOBEC3 G蛋白可在HepG2 2.2.15細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染APOBEC3G重組質(zhì)粒的HepG2.2.15細(xì)胞的HBsAg.HBeAg.HBV DNA及HBV mRNA水平均明顯低于未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HepG2.2.15細(xì)胞。pcDNA3.1-APOBEC3G轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞、空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2.2.15細(xì)胞(空白對照)比較,細(xì)胞周期無明顯變化[各期細(xì)胞所占比例分別為：G0/G1:(64.27±1.26)%vs(64.18±1.24) %vs (64.09±1.30)5,P0.05;S:(23.16±1.38)%vs (22.67±1.41)%vs (23.27±1.43)%,P0.05；G2/M:(11.36±1.26)%vs (11.84±1.31)%vs (11.37±1.22)%,P0.05],未見細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,細(xì)胞的生長增殖無明顯變化,細(xì)胞遷徙運動能力無明顯變化[24h及48h細(xì)胞遷移抑制率分別為：(7.5±3.7)%vs (10.2±5.5)%,P0.05;(13.4±6.5)%vs (17.8±9.2)%,P0.05].實驗結(jié)果證實：APOBEC3G明顯抑制了HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制與表達(dá),高表達(dá)APOBEC3G對HepG2.2.15細(xì)胞生物學(xué)行為無明顯影響。成功構(gòu)建APOBEC3G真核表達(dá)載體為深入研究APOBEC3G抗HBV的作用機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)。 (2)APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染類型患者中的表達(dá)及其細(xì)胞內(nèi)定位：用Western blot及激光掃描共聚焦顯微鏡,以健康人為對照,檢測不同慢性HBV感染類型患者(慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相關(guān)性肝癌)的PBMC及肝組織中APOBEC3G的表達(dá)狀況及其亞細(xì)胞定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：健康人PBMC中APOBEC3G表達(dá)水平極低,慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化和HBV相關(guān)性肝癌患者PBMC中APOBEC3G蛋白相對表達(dá)水平倍數(shù)分別為4.12±0.21、4.07±0.28、4.16±0.36、4.21±0.39,均高于健康人。但不同慢性HBV感染類型患者之間兩兩比較,PBMC中APOBEC3G的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Q值分別為0.931、0.744、1.675、1.675、2.606、0.931,P值均0.05)。慢性乙型肝炎患者與HBV相關(guān)性肝癌患者比較,肝組織中APOBEC3G表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(4.40±0.34與4.34±0.43,Q=0.588,P0.05)。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示PBMC中或肝組織中APOBEC3G表達(dá)定位于胞質(zhì)中,胞核中無表達(dá)。實驗結(jié)果提示：慢性HBV感染患者雖有APOBEC3G的表達(dá)升高,可能只是HBV慢性感染的伴隨表現(xiàn),APOBEC3G是否參與機(jī)體抵御HBV感染的過程尚不清楚。 (3)干擾素-α在體內(nèi)外誘導(dǎo)APOBEC3G及STAT-1的表達(dá)及其機(jī)制：應(yīng)用不同濃度的干擾素(IFN)-a刺激HepG2.2.15細(xì)胞,接著應(yīng)用RT-PCR及Western-blot檢測細(xì)胞中APOBEC3G及STAT-1的表達(dá)水平變化。另外,選取對IFN-α抗病毒治療完全應(yīng)答的CHB患者5例(A組)、無應(yīng)答患者8例(B組),應(yīng)用RT-PCR及Western-blot檢測觀察兩組患者肝組織中APOBEC3G及STAT-1的表達(dá)水平差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IFN-α明顯抑制了HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制與表達(dá),同時增強了HepG2.2.15細(xì)胞中APOBEC3G基因的表達(dá),并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量、時間依賴關(guān)系。而且,觀察到STAT-1的表達(dá)也相應(yīng)地逐漸升高。對IFN-α抗病毒治療完全應(yīng)答的CHB患者肝組織中STAT-1及APOBEC3G的表達(dá)水平明顯高于對IFN-α抗病毒治療無應(yīng)答的CHB患者。實驗結(jié)果提示：誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)APOBEC3G的表達(dá)可能是IFN-α抑制HBV的抗病毒機(jī)制之一,并且IFN-α可能通過JAK-STAT信號通道誘導(dǎo)APOBEC3G的表達(dá)。而且,對IFN-α抗病毒治療無應(yīng)答的CHB患者產(chǎn)生干擾素抵抗的機(jī)制可能與STAT-1的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

peDNA3.l一ApoBEC3G的質(zhì)粒圖譜

mP石eillinCMV啟動創(chuàng)予J刀啟動子EPeDNA3.1·APOBEC3G6.6KbVSePitoPe-_BGHpo，vASV40PolyAflOriSV40OriNeom界inNA3.l一ApoBEC3G的質(zhì)粒圖譜

圖3APOBEC3G蛋白表達(dá)的W七stern一bI0t鑒定l:轉(zhuǎn)染peDNA3.1一ApOBEC3G的HepG2.2.15細(xì)胞;2:轉(zhuǎn)染空pG2.2.15細(xì)胞;3:未轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞。l熱2345678POB思C3C嚎黔鱷驪蘸祥蘸啼贏卜‘{嘿鬢嘿矍纂巍蕊:麟撰黝圖4高表達(dá)1一6:轉(zhuǎn)染APOBEC3G單克隆細(xì)胞株的W七stern一blot鑒定PeDNA3.l一APOBEC3G7:轉(zhuǎn)染空載體的HePG2.2.巧細(xì)胞;的HepG2.2.15細(xì)胞;8:未轉(zhuǎn)染的HePG2.2.巧細(xì)胞。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;肝衰竭診療指南[J];中華肝臟病雜志;2006年09期

本文編號：2842262