APOBEC3G(載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣3G)是一種RNA/DNA編輯酶,具有胞苷脫氨酶活性,可使胞嘧啶(C)脫氨基變?yōu)槟蜞奏?U),從而誘導病毒基因組發(fā)生堿基突變,導致病毒整個復制周期終止,具有很強的抗逆轉錄病毒活性。研究證實：APOBEC3G能抑制vif缺陷人類免疫缺陷病毒(HIV)-1及乙型肝炎病毒(HBV)復制。然而,APOBEC3G抑制HBV復制的具體作用機制,APOBEC3G基因在人體細胞中的其它生物學功能及其作用機制尚不清楚。另外,正常情況下,由于肝細胞不表達APOBEC3G或表達量相對很低,因此在HBV感染過程中,不同臨床轉歸類型的慢性HBV感染患者之間,外周血及肝細胞中APOBEC3G表達是否會存在差異,APOBEC3G是否在慢性HBV感染患者機體內發(fā)揮了抗HBV作用,目前也不清楚。基于上述研究背景,本研究首先構建表達APOBEC3G蛋白的重組真核表達載體,并將其轉染入HepG2.2.15細胞中,在體外初步探討APOBEC3G對HBV復制表達的影響,觀察HepG2.2.15細胞在高表達APOBEC3G后,APOBEC3G對細胞生長遷移能力、細胞周期和凋亡現(xiàn)象等生物學行為的影響。接著,觀察APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染類型(慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相關性肝癌)患者的外周血單個核細胞(PBMC)及肝組織中的表達水平及其細胞內定位。最后,通過體內外實驗探討Janus激酶-信號傳導和轉錄激活子(JAK-STAT)信號傳導系統(tǒng)是否參與了APOBEC3G基因的轉錄調節(jié),以及慢性乙型肝炎(CHB)患者發(fā)生干擾素抵抗的分子機制。 (1)APOBEC3G基因對HepG2.2.15細胞生物學行為的影響：應用RT-PCR法從人PBMC中擴增APOBEC3G基因,分子克隆法構建表達APOBEC3G蛋白的真核表達載體pcDNA3.1-APOBEC3G,并應用脂質體法將pcDNA3.1-APOBEC3G轉染入HepG2.2.15細胞中,Western-blot鑒定細胞中APOBEC3G蛋白的表達。ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg水平,實時定量PCR檢測HBV DNA和HBV mRNA水平。應用有限稀釋法篩選出高表達APOBEC3G的HepG2.2.15細胞,并通過Western-blot鑒定。應用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡；應用MTT法檢測細胞株生長能力；應用劃痕法觀察細胞遷徙運動能力。結果顯示：酶切鑒定證實APOBEC3G真核表達載體被成功構建,Western-blot證實APOBEC3 G蛋白可在HepG2 2.2.15細胞中表達。轉染APOBEC3G重組質粒的HepG2.2.15細胞的HBsAg.HBeAg.HBV DNA及HBV mRNA水平均明顯低于未轉染重組質粒的HepG2.2.15細胞。pcDNA3.1-APOBEC3G轉染的HepG2.2.15細胞、空載體pcDNA3.1轉染的HepG2.2.15細胞與未轉染質粒的HepG2.2.15細胞(空白對照)比較,細胞周期無明顯變化[各期細胞所占比例分別為：G0/G1:(64.27±1.26)%vs(64.18±1.24) %vs (64.09±1.30)5,P0.05;S:(23.16±1.38)%vs (22.67±1.41)%vs (23.27±1.43)%,P0.05；G2/M:(11.36±1.26)%vs (11.84±1.31)%vs (11.37±1.22)%,P0.05],未見細胞凋亡現(xiàn)象,細胞的生長增殖無明顯變化,細胞遷徙運動能力無明顯變化[24h及48h細胞遷移抑制率分別為：(7.5±3.7)%vs (10.2±5.5)%,P0.05;(13.4±6.5)%vs (17.8±9.2)%,P0.05].實驗結果證實：APOBEC3G明顯抑制了HepG2.2.15細胞中HBV的復制與表達,高表達APOBEC3G對HepG2.2.15細胞生物學行為無明顯影響。成功構建APOBEC3G真核表達載體為深入研究APOBEC3G抗HBV的作用機制奠定實驗基礎。 (2)APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染類型患者中的表達及其細胞內定位：用Western blot及激光掃描共聚焦顯微鏡,以健康人為對照,檢測不同慢性HBV感染類型患者(慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相關性肝癌)的PBMC及肝組織中APOBEC3G的表達狀況及其亞細胞定位。結果發(fā)現(xiàn)：健康人PBMC中APOBEC3G表達水平極低,慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化和HBV相關性肝癌患者PBMC中APOBEC3G蛋白相對表達水平倍數(shù)分別為4.12±0.21、4.07±0.28、4.16±0.36、4.21±0.39,均高于健康人。但不同慢性HBV感染類型患者之間兩兩比較,PBMC中APOBEC3G的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(Q值分別為0.931、0.744、1.675、1.675、2.606、0.931,P值均0.05)。慢性乙型肝炎患者與HBV相關性肝癌患者比較,肝組織中APOBEC3G表達水平差異無統(tǒng)計學意義(4.40±0.34與4.34±0.43,Q=0.588,P0.05)。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示PBMC中或肝組織中APOBEC3G表達定位于胞質中,胞核中無表達。實驗結果提示：慢性HBV感染患者雖有APOBEC3G的表達升高,可能只是HBV慢性感染的伴隨表現(xiàn),APOBEC3G是否參與機體抵御HBV感染的過程尚不清楚。 (3)干擾素-α在體內外誘導APOBEC3G及STAT-1的表達及其機制：應用不同濃度的干擾素(IFN)-a刺激HepG2.2.15細胞,接著應用RT-PCR及Western-blot檢測細胞中APOBEC3G及STAT-1的表達水平變化。另外,選取對IFN-α抗病毒治療完全應答的CHB患者5例(A組)、無應答患者8例(B組),應用RT-PCR及Western-blot檢測觀察兩組患者肝組織中APOBEC3G及STAT-1的表達水平差異。結果發(fā)現(xiàn)：IFN-α明顯抑制了HepG2.2.15細胞中HBV的復制與表達,同時增強了HepG2.2.15細胞中APOBEC3G基因的表達,并在一定范圍內呈現(xiàn)劑量、時間依賴關系。而且,觀察到STAT-1的表達也相應地逐漸升高。對IFN-α抗病毒治療完全應答的CHB患者肝組織中STAT-1及APOBEC3G的表達水平明顯高于對IFN-α抗病毒治療無應答的CHB患者。實驗結果提示：誘導細胞內APOBEC3G的表達可能是IFN-α抑制HBV的抗病毒機制之一,并且IFN-α可能通過JAK-STAT信號通道誘導APOBEC3G的表達。而且,對IFN-α抗病毒治療無應答的CHB患者產生干擾素抵抗的機制可能與STAT-1的表達下調有關。
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

peDNA3.l一ApoBEC3G的質粒圖譜

mP石eillinCMV啟動創(chuàng)予J刀啟動子EPeDNA3.1·APOBEC3G6.6KbVSePitoPe-_BGHpo，vASV40PolyAflOriSV40OriNeom界inNA3.l一ApoBEC3G的質粒圖譜

圖3APOBEC3G蛋白表達的W七stern一bI0t鑒定l:轉染peDNA3.1一ApOBEC3G的HepG2.2.15細胞;2:轉染空pG2.2.15細胞;3:未轉染的HepG2.2.15細胞。l熱2345678POB思C3C嚎黔鱷驪蘸祥蘸啼贏卜‘{嘿鬢嘿矍纂巍蕊:麟撰黝圖4高表達1一6:轉染APOBEC3G單克隆細胞株的W七stern一blot鑒定PeDNA3.l一APOBEC3G7:轉染空載體的HePG2.2.巧細胞;的HepG2.2.15細胞;8:未轉染的HePG2.2.巧細胞。
【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;肝衰竭診療指南[J];中華肝臟病雜志;2006年09期

本文編號：2842262