乙型肝炎病毒(HBV),為嗜肝DNA病毒科家族成員,能夠引起一系列疾病,包括自限性急性肝炎、暴發(fā)性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝細(xì)胞癌。慢性乙型肝炎病毒感染,仍然是一個嚴(yán)重危害健康的全球性疾病問題。據(jù)估計,目前全球約有四億人為慢性HBV感染者,我國是乙肝高發(fā)地區(qū),其中1%的慢性乙肝發(fā)展為重型肝炎,預(yù)后差。HBV編碼病毒蛋白被認(rèn)為在肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用,例如影響病毒的復(fù)制和調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)等。本實(shí)驗(yàn)室前期的結(jié)果證明：HBV編碼HBc蛋白和HBx蛋白能夠通過MAPK信號途徑激活轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2,使其與人纖維介素基因fg12啟動子上的順式作用元件特異性結(jié)合,進(jìn)而激活該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 凋亡是人類肝臟疾病中最常見的肝細(xì)胞損傷機(jī)制。盡管有很多刺激和機(jī)制能夠引起凋亡,肝細(xì)胞卻特異性的對死亡受體引起的凋亡更易感。至少有三類腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員參與介導(dǎo)HBV感染時肝細(xì)胞的凋亡過程,分別為TNF、Fas配體(Fasl)和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apop tosis inducing ligand, TRAIL)。TRAIL為一類Ⅱ型跨膜蛋白,屬TNF超家族成員,通過與廣泛表達(dá)于靶細(xì)胞表面的TRAIL受體結(jié)合,繼而將凋亡信號傳遞給caspase,誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡,而對正常的細(xì)胞不發(fā)揮或發(fā)揮極微弱的作用。TRAIL在肝細(xì)胞死亡中的作用至今仍存在爭議,最初在動物模型中的研究認(rèn)為與TNF和Fasl不同,TRAIL并不引起正常肝細(xì)胞的凋亡。然而,隨著研究的進(jìn)一步開展發(fā)現(xiàn),TRAIL能誘導(dǎo)病毒感染、脂肪酸浸潤后的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。在HBV導(dǎo)致的肝臟損害中,TRAIL的表達(dá)明顯增強(qiáng),其表達(dá)水平與肝臟損害程度呈顯著正相關(guān),提示TRAIL參與了HBV導(dǎo)致的重型肝炎的發(fā)病機(jī)制。 首先,我們設(shè)計進(jìn)行了以下試驗(yàn)來探討HBV編碼相關(guān)蛋白是否對人TRAIL基因具有激活作用。pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx分別為三種HBV編碼蛋白HBc、HBs和HBx的真核表達(dá)質(zhì)粒,我們將上述質(zhì)粒分別與hTRAIL啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒及pRL-TK海腎螢光素酶對照報告基因質(zhì)粒(pRL-TK)共轉(zhuǎn)染到HepG2肝癌細(xì)胞系。來研究HBV編碼的蛋白是否對hTRAIL基因具有激活作用；若有作用,是何種病毒蛋白發(fā)揮活化基因的作用。通過檢測報告基因相對熒光素酶(LUC)值反映病毒蛋白對hTRAIL啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用,結(jié)果顯示,HBx蛋白能激活hTRAIL基因啟動子的轉(zhuǎn)錄；采用實(shí)時熒光定量和Western Bloting結(jié)果顯示相對熒光素酶的結(jié)果提示：在HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染pcDNA-HBx組hTRAIL基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組。而HBc蛋白和HBs蛋白則不能激活該基因的表達(dá)。 為研究HBV編碼HBx蛋白作用下,參與激活hTRAIL基因的順式作用元件及反式作用因子,我們進(jìn)行了系列啟動子裁截缺失試驗(yàn),即構(gòu)建了一系列5’端缺失而具有共同3’端的hTRAIL基因啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒,將其分別與HBV編碼HBx蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。結(jié)果表明：在hTRAIL基因啟動子-89位至-29位(相對于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn))之間區(qū)域存在著重要的調(diào)控序列。為進(jìn)一步探討該區(qū)域內(nèi)是否存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),我們利用生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了分析,結(jié)果提示有三個主要候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)存在于hTRAIL基因啟動子的-89位至-29位之間。為了確定起決定作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),我們采用Quick-Change定點(diǎn)突變方法,對hTRAIL基因啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒的這三個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行定點(diǎn)突變,酶切結(jié)果和測序結(jié)果證實(shí)三個位點(diǎn)均突變成功。在HepG2肝癌細(xì)胞系將HBx真核表達(dá)質(zhì)粒與突變后的hTRAIL啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),檢測熒光素酶值結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HBx作用下,兩個sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分別突變后質(zhì)粒的相對熒光素酶活性降低50.1%和52.4%,而其他位點(diǎn)突變后相對熒光素酶活性沒有發(fā)生顯著性改變。凝膠遷移試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染病毒蛋白HBx真核表達(dá)質(zhì)粒后,HepG2細(xì)胞核蛋白能與含有sp1的hTRAIL基因啟動子探針特異性結(jié)合,而且轉(zhuǎn)錄因子sp1的抗體能使該結(jié)合條帶發(fā)生遷移,凝膠遷移實(shí)驗(yàn)說明HBx蛋白能使轉(zhuǎn)錄因子sp1與hTRAIL基因啟動子上相應(yīng)的順式作用元件位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合。我們用sp1抗體進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)來研究在乙型肝炎病毒蛋白HBx作用下與轉(zhuǎn)錄因子sp1結(jié)合的DNA序列是否存在于是hTRAIL基因啟動子上的順式作用元件。結(jié)果表明：在HBx蛋白作用下,以與轉(zhuǎn)錄因子sp1結(jié)合的DNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可擴(kuò)增到長度為206bp的序列,該序列位于hTRAIL基因啟動子上,并包含-89位至-29位(相對于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)),進(jìn)一步證實(shí)在乙型肝炎HBx病毒蛋白作用下,sp1是激活hTRAIL基因所必需的轉(zhuǎn)錄因子。為了檢測轉(zhuǎn)錄因子sp1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,我們采用共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了HBx真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HBx后,在胞核及胞漿中均可見sp1蛋白的表達(dá),與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組以、HBs及HBc真核表達(dá)質(zhì)粒組相比,HBx組sp1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。采用RNA干擾的方法對HepG2細(xì)胞中sp1的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示sp1表達(dá)的抑制可使hTRAIL啟動子熒光素酶的相對熒光素酶值降低64.8%,此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子sp1是病毒蛋白HBx激活hTRAIL基因所必需的重要作用因子。上述試驗(yàn)結(jié)果表明,病毒蛋白HBx激活宿主hTRAIL基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是通過活化轉(zhuǎn)錄因子sp1,后者發(fā)生核轉(zhuǎn)位,并與核內(nèi)hTRAIL基因啟動子(-89位至-29位之間)上的相應(yīng)順式作用元件特異性結(jié)合。 以上結(jié)果說明,乙型肝炎病毒編碼HBx蛋白通過激活轉(zhuǎn)錄因子sp1,后者核移位,并與hTRAIL基因啟動子上相應(yīng)的順式作用元件進(jìn)行特異性結(jié)合,進(jìn)而上調(diào)了hTRAIL基因的表達(dá)。本研究從病毒蛋白與宿主基因相互作用方面闡明了hTRAIL基因高度表達(dá)的分子機(jī)制,進(jìn)一步闡明了HBV感染后肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,而sp1轉(zhuǎn)錄因子有可能成為重型肝炎干預(yù)的又一分子靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62
【文章目錄】：
全文縮略語對照表
中文摘要
Abstract
第一章 乙型肝炎病毒編碼蛋白對hTRAIL基因的激活作用
    第一部分 乙型肝炎病毒編碼蛋白對hTRAIL基因的
        中文摘要
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        討論
        參考文獻(xiàn)
    第二部分 HBx病毒蛋白作用下參與hTRAIL基因轉(zhuǎn)錄激活作用的轉(zhuǎn)錄因子以及順式作用元件的研究
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        討論
        參考文獻(xiàn)
第二章 乙型肝炎病毒變異影響宿主炎性基因fgl2表達(dá)的分子機(jī)制研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Hepatitis B virus X protein regulates the mEZH2 promoter via the E2F1-binding site in AML12 cells[J];癌癥;2011年04期

2 ;Antiviral therapy for hepatitis B virus associated hepatic failure[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2009年01期

3 Kazuhiro Kotoh;Masaki Kato;Motoyuki Kohjima;Makoto Nakamuta;Munechika Enjoji;;A new treatment strategy for acute liver failure[J];World Journal of Hepatology;2010年11期

4 ;Detection of soluble TRAIL in HBV infected patients and its clinical implications[J];World Journal of Gastroenterology;2002年06期

5 Gary Levy;;Fibrinogen-like protein 2 fibroleukin expression and its correlation with disease progression in murine hepatitis virus type 3-induced fulminant hepatitis and in patients with severe viral hepatitis B[J];World Journal of Gastroenterology;2005年44期

6 ;Fibrinogen-like protein 2/fibroleukin prothrombinase contributes to tumor hypercoagulability via IL-2 and IFN-γ[J];World Journal of Gastroenterology;2008年39期

本文編號：2842293