目的小檗堿是由黃連、黃柏等植物中提取出的生物堿,可以改善糖脂代謝紊亂。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為小檗堿通過激活腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)降糖調(diào)脂。然而我們前期的研究發(fā)現(xiàn)線粒體復(fù)合物Ⅰ才是小檗堿刺激糖酵解、促進(jìn)葡萄糖消耗的真正靶點(diǎn),而不依賴于AMPK通路,但小檗堿降脂與線粒體復(fù)合物Ⅰ間的關(guān)系尚不明確。本研究旨在進(jìn)一步探討小檗堿是否是通過抑制線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ來調(diào)控脂質(zhì)代謝紊亂。方法6周齡C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為四組,分別為低脂對(duì)照組、高脂組、高脂+小檗堿組、高脂+魚藤酮組,將藥物摻在飼料中飼喂小鼠。定期監(jiān)測小鼠體重、隨機(jī)血糖;采用小鼠代謝籠了解小鼠基礎(chǔ)代謝情況;提取小鼠肝臟線粒體,檢測其耗氧率及檸檬酸合酶活性;透射電鏡觀察肝臟線粒體大小、形態(tài)和數(shù)目變化;Western blot分別檢測肝臟脂代謝各通路相關(guān)基因的蛋白表達(dá)情況;酶化學(xué)法檢測脂肪酸氧化關(guān)鍵酶的活性。油酸誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞脂肪變,給予小檗堿和魚藤酮處理。檢測甘油三酯含量及上清液中游離脂肪酸含量;Western blot檢測AMPK及其下游乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化水平;裂解肝細(xì)胞用試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量。結(jié)果1.小檗堿和魚藤酮可以降低高脂小鼠體重,改善胰島素抵抗,也可使小鼠原代肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積減少。2.小檗堿和魚藤酮可顯著降低線粒體氧耗率,抑制復(fù)合物Ⅰ功能;使檸檬酸合酶活性和mtDNA含量下降,促進(jìn)肝臟線粒體融合,ATP合成減少。3.小檗堿組和魚藤酮組脂肪酸攝取、脂質(zhì)合成以及脂肪酸氧化相應(yīng)基因的蛋白表達(dá)均下降,脂肪酸氧化中肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶及β-酮硫解酶活性也下降,經(jīng)小檗堿及魚藤酮處理后的小鼠原代肝細(xì)胞對(duì)脂肪酸的消耗減少。結(jié)論小檗堿通過抑制線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ改善脂代謝。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

結(jié)果1. 小檗堿對(duì)高脂喂養(yǎng)（HFD）小鼠體重和攝食量的影響低脂、高脂及高脂加藥飼料喂養(yǎng) 6 周后，高脂組體重較低脂對(duì)照組明顯增高，小檗堿和魚藤酮組體重較高脂組明顯下降（圖 1A），隨著喂養(yǎng)時(shí)間的增加，組間體重差異越來越明顯，喂養(yǎng) 5 個(gè)月后，低脂對(duì)照組平均體重為 27.5g，高脂組平均體重為 42.7 g，小檗堿組平均體重為 29.9 g，魚藤酮組平均體重為 30.9 g，同時(shí)骨密度儀也直觀反映出不同處理組小鼠的體重差異（圖 1B）。四組小鼠的瘦體重（leanmass）沒有明顯差異，而小檗堿、魚藤酮組脂肪含量（fatmass）及脂肪占比（fat mass/bodymass）較高脂組明顯減少（圖 1C-E）。各組間的攝食量沒有明顯差異（圖 1F）。以上結(jié)果表明小檗堿可顯著降低小鼠體重，而不影響其攝食量。

The results are shown as means ±SEM; n=10;#P <0.05 vs LFD. *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001 vs HFD2. 小檗堿對(duì)高脂喂養(yǎng)（HFD）小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性的影響腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（IPGTT）結(jié)果表明，過夜禁食 12 小時(shí)后，小檗堿及魚藤酮給藥組空腹血糖無顯著差異，而糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)的血糖值均明顯低于高脂組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2A，P<0.05），且 IPGTT 曲線下面積明顯低于高脂組小鼠（圖 2B，P<0.001）。胰島素耐量試驗(yàn)（ITT）結(jié)果顯示，禁食 6 小時(shí)后，小檗堿及魚藤酮給藥組空腹及注射胰島素后各時(shí)間點(diǎn)的血糖值均顯著低于高脂對(duì)照組小鼠（圖 2C，P<0.05），且 ITT 曲線下面積也明顯低于高脂對(duì)照組小鼠（圖 2D，P < 0.0001）。以上結(jié)果提示小檗堿可以明顯改善高脂喂養(yǎng)小鼠的葡萄糖耐量異常，改善高脂喂養(yǎng)所致的胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素敏感性。

即該劑量有細(xì)胞毒性。如圖4B 所示，0.2、0.4、0.6、0.8、1mmol·L-1油酸可使小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯較對(duì)照組分別增加 9.3%（P<0.001）、28.2%、41.3%、49%、49.1%（P<0.0001）。因 1mmol·L-1影響細(xì)胞生長，因此將既未造成細(xì)胞存活率的下降又能最大化誘導(dǎo)脂肪變的 0.8 mmol·L-1作為油酸誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞脂肪變的濃度。圖 4 油酸誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞脂肪變濃度篩選Fig4. OAconcentration selection for inducing primary hepatocytes steatosis.The results are shown as means ±SEM. n=4;***P<0.001;****P<0.0001 vs control.6. 不同劑量的小檗堿對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞活細(xì)胞百分比的影響在探究小檗堿和魚藤酮對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響前，先檢測不同劑量的小檗堿和魚藤酮對(duì)原代肝細(xì)胞活性的影響，以判斷小檗堿和魚藤酮的
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