【研究背景及目的】 肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟對慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng),以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝內(nèi)過多沉積為特征。肝纖維化為一動態(tài)過程,屬可逆性病變,因此,阻斷、抑制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療慢性肝病的一個重要目標(biāo)。 既往認(rèn)為,肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)激活并向肌成纖維樣細(xì)胞(myofibroblasts,MFs)轉(zhuǎn)化,抑制HSC激活、增殖與遷移、誘導(dǎo)凋亡是肝纖維化治療的重要策略。近年來研究發(fā)現(xiàn),在靜息狀態(tài)下,HSC可能是一種上皮細(xì)胞,對肝干細(xì)胞的分化和增殖以及肝細(xì)胞功能維持均起重要作用。此外也有研究顯示,肝實質(zhì)細(xì)胞如肝細(xì)胞以及膽管上皮細(xì)胞均可能轉(zhuǎn)化為MFs,參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此,抑制HSC活化和增殖可能不是治療肝纖維化的最好策略,迫切需要針對肝纖維化發(fā)病的新機(jī)制重新確立新的有效治療方法。 上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)主要是指上皮細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞功能以及細(xì)胞粘附、遷移能力等方面獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。目前,EMT在肝臟、腎臟、肺臟等器官纖維化進(jìn)程中的重要作用已經(jīng)得到證實。一系列研究也表明,肝細(xì)胞、HSC、膽管上皮細(xì)胞也通過EMT轉(zhuǎn)化為MFs,參與肝纖維化進(jìn)程。這些研究重新認(rèn)識了肝臟實質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞作用,是肝纖維化機(jī)制與治療領(lǐng)域新的突破。 肝細(xì)胞核因子4(hepatocyte nuclear factor,HNF4)是一種屬于細(xì)胞核激素受體家族的轉(zhuǎn)錄因子,在分化成熟的肝細(xì)胞中高表達(dá),其中HNF4α是HNF4的重要亞型。HNF4α參與維護(hù)肝細(xì)胞脂肪代謝、白蛋白合成、藥物解毒、能量代謝、膽汁酸合成等重要功能,也是調(diào)控上皮細(xì)胞表型(如緊密連接、粘附連接、縫隙連接、橋粒以及細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間粘附分子、上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞骨架蛋白等)表達(dá)的重要基因。 晚近研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生EMT并伴有HNF4α表達(dá)下調(diào);上調(diào)HNF4α表達(dá)可阻斷EMT重要轉(zhuǎn)錄因子Snail基因誘導(dǎo)的肝細(xì)胞EMT發(fā)生;上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞NIH-3T3中HNF4α表達(dá)可使其向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)型(mesenchymal-to-epithelial transition,MET),表明HNF4α對EMT有重要的調(diào)控作用�；谝陨涎芯拷Y(jié)果我們推測,HNF4α將可能阻斷肝纖維化進(jìn)程中肝細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)化為MFs,從而維持其上皮細(xì)胞表型和肝細(xì)胞功能。更為重要的是,上調(diào)HNF4α基因在HSC中表達(dá),將可能促使活化HSC向上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,從而達(dá)到既抑制活化HSC的問質(zhì)細(xì)胞特性,又發(fā)揮其促進(jìn)肝臟再生和肝干細(xì)胞分化的作用。 本課題在明確肝纖維化進(jìn)程中HNF4α表達(dá)下降的基礎(chǔ)上,將攜帶HNF4α的重組腺病毒—AdHNF4α經(jīng)尾靜脈注射導(dǎo)入肝纖維化大鼠體內(nèi),明確上調(diào)HNF4α基因表達(dá)對實驗性肝纖維化的抑制作用;通過上調(diào)經(jīng)TGF-β1刺激后原代培養(yǎng)肝細(xì)胞和活化HSC HNF4α的表達(dá),檢測上述細(xì)胞EMT相關(guān)基因和生物學(xué)功能變化,闡述HNF4α通過阻斷EMT進(jìn)而抑制肝纖維化的作用機(jī)制,為肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和治療研究提供新的思路。 【實驗方法】 一、HNF4α抑制肝纖維化進(jìn)程中EMT的體內(nèi)研究 1.利用AdEasy~(TM)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)HNF4α的重組腺病毒—AdHNF4α,293細(xì)胞包裝并反復(fù)感染,擴(kuò)增高效表達(dá)HNF4α的AdHNF4α和空白對照病毒AdGFP,濃縮純化、測定滴度后保存。 2.AdHNF4α抑制DMN損傷大鼠的肝纖維化進(jìn)程 將雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機(jī)分為4組,第1組為正常對照組(n=10);2-4組為肝纖維化模型組,予1%二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)以10μg/kg腹腔注射,每周連續(xù)注射3次,共注射5w。其中第2組設(shè)為模型對照組(n=30),第3組為AdGFP導(dǎo)入組(n=10),第4組設(shè)為AdHNF4α導(dǎo)入組(n=10)。分別在第2w、4w處死模型組大鼠各10只。于DMN注射4w后AdHNF4α組和AdGFP組分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入4×10~9 pfu/只AdHNF4α或4×10~9 pfu/只AdGFP,注射病毒2w后處死大鼠,分別觀察各組大鼠肝功能指標(biāo)及凝血酶原時間(prothrombin time,PT)變化;免疫組織化學(xué)法測定肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá);HE和VG染色測定ECM含量并對肝纖維化程度分級,圖象分析儀半定量分析。 3.AdHNF4α對膽管結(jié)扎(bile duct ligation,BDL)大鼠肝纖維化進(jìn)程的抑制作用 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組,每組12只,分設(shè)假手術(shù)組、膽總管結(jié)扎組、空白病毒AdGFP導(dǎo)入組和AdHNF4α導(dǎo)入組。鈍性分離并結(jié)扎膽總管,制備BDL肝纖維化模型。術(shù)后2d AdGFP組和AdHNF4α組分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入4×10~9 pfu/只AdGFP或4×10~9 pfu/只AdHNF4α;3w后處死大鼠,觀察指標(biāo)同DMN模型。 4.Real time RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法,分別檢測正常、DMN肝損傷2w和4w大鼠肝組織HNF4α及EMT相關(guān)基因的表達(dá);同時檢測HNF4α導(dǎo)入后HNF4α及EMT相關(guān)基因的表達(dá),評估對實驗性肝纖維化的抑制效果。 二、上調(diào)HNF4α表達(dá)對肝細(xì)胞EMT的作用 分離制備原代培養(yǎng)SD大鼠肝細(xì)胞,培養(yǎng)2d后,換成含有2ng/ml TGF-β1無血清培養(yǎng)基,同時將AdGFP或AdHNF4α以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)10感染肝細(xì)胞,動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化;收集感染48h、72h后細(xì)胞,抽提總RNA和蛋白。Real time RT-PCR法檢測肝細(xì)胞HNF4α、白蛋白(albumin,ALB)、谷胺酰氨合成酶(glutamine synthetase,GS)、細(xì)胞色素P450家族1A2(c)rtochrome P4501A2,CYP1A2)、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snail、Ⅰ型膠原mRNA水平表達(dá)。 三、上調(diào)HNF4α表達(dá)對HSC細(xì)胞表型和生物學(xué)活性的影響 AdGFP或AdHNF4α分別以MOI 50感染大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6,動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化;收集感染后48h、72h細(xì)胞,抽提總RNA和蛋白。Real time RT-PCR法檢測細(xì)胞HNF4α、ALB、GS、CYP1A2、E-cadherin、Vimentin、Snail、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、組織金屬蛋白酶抑制-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)基因mRNA水平表達(dá)變化;細(xì)胞免疫熒光方法檢測HNF4α、Vimentin表達(dá);繪制感染前后細(xì)胞增殖曲線。 四、統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析,結(jié)果以(?)±S表示。多組間采用One-WayANOVA分析,方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗;P＜0.05為具有顯著性差異,P＜0.01為具有非常顯著性差異。 【實驗結(jié)果】 一、HNF4α體內(nèi)導(dǎo)入對實驗性肝纖維化的抑制作用 1.DMN損傷肝纖維化進(jìn)程中EMT相關(guān)基因表達(dá)變化:Real time RT-PCR檢測DMN注射2w和4w大鼠肝組織中HNF4α和上皮細(xì)胞表型基因E-cadherin mRNA水平表達(dá)較正常組明顯降低(P＜0.05),同時肝細(xì)胞功能基因白蛋白mRNA水平表達(dá)也明顯下調(diào)(P＜0.01);而間質(zhì)細(xì)胞表型基因Snail、Vimentin表達(dá)均較正常組明顯增加(P＜0.05)。 2.HNF4α對DMN肝纖維化模型的抑制作用:HNF4α基因?qū)虢M血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)及PT值分別為113.2±21.6 U/L、23.8±1.41s,較模型對照組(163.8±19.4 U/L、29.4±1.63 s)和AdGFP組(165.2±27.1 U/L、27.4±1.96s)明顯降低(P＜0.05);HNF4α基因?qū)虢M肝組織羥脯氨酸含量為217.16±42.51μg/g,較模型對照組(341.07±81.20μg/g)和AdGFP組(361.37±112.83μg/g)明顯減少(P＜0.05)。HNF4α組膠原染色面積約為AdGFP組的49%(P＜0.05),免疫組化表明Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)較AdGFP組均顯著下降(P＜0.05)。 3.HNF4α對BDL模型肝纖維化的抑制作用:HNF4α基因?qū)虢M血清ALT、AST分別為86.4±13.9U/L、523.6±90.0 U/L,較AdGFP組(127.8±13.9 U/L、726.8±129.7 U/L)有明顯差異(P＜0.05);治療組膠原染色面積約為AdGFP組的52%(P＜0.05),免疫組化表明Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)較AdGFP組均顯著下降(P＜0.05)。 4.HNF4α對DMN損傷肝纖維化模型肝組織ALB和EMT相關(guān)基因表達(dá)影響:AdHNF4α導(dǎo)入組ALB和E-cadherin mRNA表達(dá)較AdGFP導(dǎo)入組及模型組顯著增加(P＜0.01),而Snail、Vimentin表達(dá)均顯著減少(P＜0.05)。 二、HNF4α對TGFβ1誘導(dǎo)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞EMT的影響 1.將含有TGF-β1無血清培養(yǎng)基刺激原代大鼠肝細(xì)胞24 h后,肝細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;48 h后可見較多死亡細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)量減少,形態(tài)由多邊形向梭形轉(zhuǎn)變;72 h后見死亡細(xì)胞進(jìn)一步增多,活細(xì)胞數(shù)量較少且大多數(shù)呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞梭形形態(tài)。Realtime RT-PCR檢測Vimentin、Snail、Ⅰ型膠原表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.05),而E-cadherin、HNF4α、ALB、GS、CYP1A2表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。 2.將MOI 10的AdHNF4α和AdGFP分別感染TGF-β1刺激的原代大鼠肝細(xì)胞,24 h后,兩組在細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)上無明顯差別,熒光顯微鏡下均可見大量GFP表達(dá);48 h后AdHNF4α組細(xì)胞死亡數(shù)量較AdGFP組明顯減少,細(xì)胞形態(tài)仍保持多邊形:72 h后AdGFP組活細(xì)胞數(shù)量較少且大多數(shù)呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞梭形形態(tài),AdHNF4α組細(xì)胞死亡細(xì)胞很少且大多仍保持多邊形形態(tài)。Real time RT-PCR檢測AdHNF4α組HNF4α表達(dá)明顯上調(diào),Vimentin、Snail和Ⅰ型膠原表達(dá)均明顯減少(P＜0.05),E-cadherin明顯增加(P＜0.05),肝細(xì)胞功能基因ALB、GS、CYP1A2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。 三、HNF4α對HSC細(xì)胞表型和生物學(xué)活性的影響 1.將AdHNF4α以MOI 50滴度感染肝星狀細(xì)胞株HSC-T6 48 h和72 h后AdHNF4α組Vimentin、Snail、Ⅰ型膠原、α-SMA和TIMP-1 mRNA水平均明顯下降(P＜0.05),E-cadherin表達(dá)明顯增加(P＜0.05),GS和CYP1A2等肝細(xì)胞功能基因明顯增強(qiáng)(P＜0.05);72h后AFP mRNA及HNF4α蛋白表達(dá)明顯增加,Vimentin蛋白表達(dá)減弱。 2.MTS法連續(xù)5d測定OD_(450)值,發(fā)現(xiàn)HNF4α導(dǎo)入HSC-T6后,細(xì)胞增殖明顯抑制,第4d OD_(450)值為0.9761±0.1151,增殖活性顯著低于對照組(陰性對照組1.4427±0.1567,AdGFP組1.3403±0.1120,P＜0.01)。 【結(jié)論】 1.肝纖維化進(jìn)程中,肝細(xì)胞HNF4α表達(dá)逐漸降低。 2.AdHNF4α體內(nèi)基因?qū)肟擅黠@抑制大鼠肝臟ECM沉積,促進(jìn)肝功能恢復(fù),是治療實驗性肝纖維化新的有效方法。 3.HNF4α基因?qū)氪笫蟾渭?xì)胞后可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的EMT,維持肝細(xì)胞正常表型,增強(qiáng)肝細(xì)胞功能。 4.HNF4α基因?qū)肟墒够罨疕SC向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)型,并抑制其MFs生物學(xué)功能。 5.HNF4α治療肝纖維化的主要機(jī)制是抑制肝細(xì)胞和HSC的EMT,恢復(fù)纖維化肝臟中肝細(xì)胞功能,并抑制活化HSC生物學(xué)活性。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

上調(diào)肝細(xì)胞核因子4a基因表達(dá)抑制實驗性肝纖維化表1一1DMN肝損傷纖維化進(jìn)程中相關(guān)基因表達(dá)變化Genes/p一actinNormal2W4WHNF4a4.7132士0.3231.1989士o.Z16aALB250.8026士30.65467.9333士3.660E一Csdherin0.6290士0.1100.2126士0.008Vimentin0.2277士0.0030.5229土0.059Snail0.0009士0.00010.002士0.00020.6396士0.13lb35.2286士15.524b0.1221士O.O28b，c0.7220士0.01lb·c0.005士0.OO17b注:“a“’Zw，‘Normal，P<0.05;‘·b”4w飛)sNormal;‘·e，’4w、百Zw，P<0.05

口尾2口口尸圖1一 10DM嘆和BDL肝纖維化模型各組大鼠肝組織Q一SMA的表達(dá) (x200)模型對照組:A、D;AdGFP導(dǎo)入組:B、E;A公介作4a導(dǎo)入組:C、F8.DMN肝纖維化模型EMT相關(guān)基因及肝細(xì)胞功能基因ALB的表達(dá)在DMN肝纖維化模型大鼠，AdHNF4a導(dǎo)入組較AdGFP導(dǎo)入組、模型對照組上皮細(xì)胞表型標(biāo)志基因E一 eadherinmRNA水平表達(dá)顯著增加(尸<0.01);間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因V加entin、Snail表達(dá)均顯著減少(尸<0.05);肝細(xì)胞功能基因ALB表達(dá)較AdGFP導(dǎo)入組、模型對照組明顯增加(尸<0.05)(表1一9;圖1一11)。表1一 9DMN肝纖維化模型EMT相關(guān)基因及肝細(xì)胞功能基因ALBm丑NA表達(dá)Gro即sE一adherinV加nentinSnanALB Ns0.6290均.2276 Model0.1951切.0171 AdGFp0.2197均.0616 0.2276均.0033 0.0009士0.0001250.8肚30.65 0.5728切.0336 0.0020幼 .000151.13幻.00 0.6080均.0861 0.0022切.000434.81土4.76AdHNF4住0.4417均.0251#，*0.3784切.0572#，*0.00一1均.0001#，*100.19士6.56#，*注:“#，， AdHNF4avsAdGFP，六0.05;“*

(I釗2一IA)，大多細(xì)J泡’社I二!1陽性率達(dá)95%以卜(圖2一2)。圖2一1原代大鼠肝細(xì)胞分離培養(yǎng)《 x200)A:新鮮分離原代川細(xì)飽臺盼藍(lán)染色:B:}馬毛代}J}細(xì)}泡士{于2蕎Zd).;‘1:長寸.，，況:圖2一2原代大鼠肝細(xì)胞ALB細(xì)胞免疫熒光染色 (x400)A:ALBB:DAPI川』lj;{l’·，
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 黃兆偉;miRNA-HNF1α調(diào)控軸在肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

本文編號：2836672