乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是目前嚴重危害全世界人類健康的病原體,其感染的危害性,主要在于病毒在被感染者體內(nèi)持續(xù)感染,導(dǎo)致機體產(chǎn)生慢性肝炎、肝損傷和肝硬化,并且與肝細胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。天然免疫中的干擾素(interferon,IFN)系統(tǒng)在抗病毒過程中發(fā)揮重要作用,干擾素不僅對病毒具有直接的抗病毒作用,而且能啟動并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫。導(dǎo)致HBV慢性感染的具體機制尚不十分清楚,但是已有的研究提示HBV的持續(xù)感染或拮抗病毒治療與病毒逃避宿主天然免疫尤其是干擾素密切相關(guān),如慢性乙肝患者中僅有30%～40%能對干擾素單獨治療有較好的應(yīng)答,提示HBV對干擾素的抗病毒作用具有拮抗作用;在肝細胞內(nèi),已發(fā)現(xiàn)HBV能通過干擾轉(zhuǎn)錄因子STAT1的轉(zhuǎn)運入核或影響STAT1的甲基化來抑制干擾素的抗病毒信號通路,并且HBV的核心蛋白Core和Pre-core可以結(jié)合抗病毒基因Mx的啟動子以抑制Mx的表達。這些臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果充分提示,HBV在肝細胞內(nèi)確實能拮抗干擾素抗病毒作用。但是,HBV在肝細胞內(nèi)是否拮抗肝細胞干擾素的產(chǎn)生及其機制尚不清楚。盡管有報道提示HBV的Core蛋白能夠在體外抑制IFN-β的產(chǎn)生,但其作用及其機制尚未在肝細胞內(nèi)得到證實。鑒于已有報道提示肝細胞本身具有很強的干擾素產(chǎn)生能力,HBV是否影響肝細胞自身的干擾素產(chǎn)生將影響到病毒能否逃脫先天免疫的監(jiān)視及其慢性感染的建立。因此,極有必要研究和了解HBV對肝細胞干擾素產(chǎn)生及信號通路的影響及其機制。 為研究HBV影響肝細胞干擾素產(chǎn)生的作用,首先比較了不同來源的肝細胞干擾素的誘生能力。分別以干擾素產(chǎn)生的強烈誘導(dǎo)劑新城疫病毒(Newcastledisease virus,NDV)刺激肝癌細胞Huh7、HepG2和肝原代細胞系PH5CH8,定量實時PCR結(jié)果顯示,與Huh7和HepG2細胞僅能微弱地被誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β相比,而PH5CH8細胞則能被誘導(dǎo)強烈地產(chǎn)生干擾素,提示原代肝細胞具有較強的干擾素產(chǎn)生能力,因此可將PH5CH8細胞作為本研究的對象。為研究HBV對肝細胞干擾素誘生的影響,在PH5CH8細胞中轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制質(zhì)粒pHBV3.8并以NDV刺激,逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制質(zhì)粒組PH5CH8細胞的IFN-βmRNA水平顯著低于對照組,提示HBV在肝細胞內(nèi)復(fù)制能抑制肝細胞自身干擾素的誘生。為進一步了解病毒復(fù)制與蛋白表達對干擾素產(chǎn)生的影響,PH5CH8細胞中分別轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制型質(zhì)粒pCMV-HBV和非復(fù)制質(zhì)粒pHBV-YMDD,結(jié)果提示與對照相比,HBV復(fù)制型質(zhì)粒能抑制細胞IFN-β的表達,而非復(fù)制型質(zhì)粒則無影響。 為進一步研究HBV對肝細胞干擾素誘生的作用,在PH5CH8細胞中共轉(zhuǎn)IFN-β啟動子報告質(zhì)粒和乙型肝炎病毒各個蛋白表達質(zhì)粒并以NDV刺激,雙熒光報告基因檢測結(jié)果提示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染HBV多聚酶(Polymerase)組的IFN-β啟動子活性顯著低于對照組,而轉(zhuǎn)染Core和X蛋白(HBx)組則無顯著差異,進一步提示HBV polymerase可能在HBV抑制肝細胞干擾素誘生過程中發(fā)揮重要作用。為驗證上述現(xiàn)象,在Huh7細胞中分別轉(zhuǎn)染HBV各蛋白表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Poly(I∶C),實時定量PCR結(jié)果提示HBV多聚酶能顯著地抑制Huh7細胞中經(jīng)Poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β的表達,而Core和HBx則對IFN-β的誘生無影響,進一步提示了HBV多聚酶在抑制肝細胞干擾素誘生中的作用。為進一步明確HBV多聚酶在抑制肝細胞干擾素誘生中的作用,將不同劑量的HBV多聚酶表達質(zhì)粒和IFN-β啟動子報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)PH5CH8細胞并分別以Poly(I∶C)和NDV刺激,結(jié)果提示HBV polymerase能以劑量依賴的形式抑制IFN-β啟動子的活性。此外,實時定量PCR結(jié)果提示HBV多聚酶亦能以劑量依賴的形式抑制Poly(I∶C)和NDV誘導(dǎo)的IFN-β的mRNA水平。以上結(jié)果提示HBV多聚酶可能是一個HBV拮抗肝細胞干擾素誘生的病毒性調(diào)節(jié)因子。 HBV多聚酶蛋白從N端至C端依次由末端蛋白(TP)、間隔區(qū)(Spacer)、DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶活性區(qū)(DNA Pol/RT)和RNA酶活性區(qū)(RNaseH)組成。為了明確HBV多聚酶的哪一段區(qū)域可能在HBV及其多聚酶抑制肝細胞干擾素誘生中的作用,分別將表達HBV多聚酶不同截短體的質(zhì)粒與IFNβ啟動子報道質(zhì)粒共轉(zhuǎn)PH5CH8細胞,結(jié)果提示各截短體對肝細胞干擾素的產(chǎn)生都有不同程度地抑制作用,但是N端691位、347位和178氨基酸序列突變體具有顯著的抑制效果,而缺失末端蛋白的截短體雖有抑制作用。但其抑制活性大大降低,提示末端蛋白在HBV多聚酶抑制肝細胞干擾素的誘生過程中發(fā)揮主要作用,但也依賴于間隔區(qū)和聚合酶活性區(qū)的作用。 由于HBV能抑制分別由Poly(I∶C)和NDV誘導(dǎo)的干擾素的產(chǎn)生,而這兩者激活的信號通路交匯于由TBK1/IKKε激活的轉(zhuǎn)錄因子IRF-3,因此,為研究HBV抑制肝細胞干擾素及其信號通路的分子機制,在Huh7細胞中共轉(zhuǎn)IFN-β啟動子報告質(zhì)粒、TBK1/IKKε、IRF-3和HBV復(fù)制質(zhì)粒,結(jié)果提示HBV能顯著地抑制TBK1/IKKε激活的IFN-β啟動子的活性,進一步提示HBV可能通過抑制TBK1/IKKε下游的信號通路來抑制肝細胞中干擾素的產(chǎn)生。鑒于IRF-3及其磷酸化激活在干擾素產(chǎn)生信號通路中的重要作用,將HBV復(fù)制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PH5CH8細胞,并分別以Poly(I∶C)和NDV刺激,通過Western blot來檢測細胞IRF-3的表達及其磷酸化狀態(tài),結(jié)果提示與對照組相比,HBV對IRF-3的磷酸化狀態(tài)無顯著影響。進一步轉(zhuǎn)染HBV各蛋白表達質(zhì)粒,結(jié)果提示這些蛋白對IRF-3的磷酸化狀態(tài)均無顯著影響,提示HBV可能通過其它機制抑制肝細胞干擾素的誘生。 綜上所述,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV在肝細胞中復(fù)制時能抑制肝細胞自身干擾素的誘導(dǎo)水平,提示這可能是HBV逃避干擾素系統(tǒng)及先天免疫的策略之一。本研究還發(fā)現(xiàn)HBV多聚酶在HBV抑制肝細胞干擾素誘生中發(fā)揮重要作用,并且作用于激酶TBK1/IKKε激活的信號通路下游。對HBV多聚酶抑制肝細胞干擾素信號通路機制的進一步研究,將有助于揭示HBV拮抗干擾素產(chǎn)生系統(tǒng)和逃避免疫的具體分子機制,也可能揭示HBV在肝細胞建立慢性感染的分子機制,并為設(shè)計和開發(fā)針對病毒的新藥物以及提高干擾素的療效等提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

7IIBv多聚酶Pol在PBSCHS細胞中對耳N一p啟SCHS細胞中共轉(zhuǎn)不同劑量的pCDNA3.l一3XFlag一pol(圖染36h后分別以50林g/inlP‘)ly(I:C)(圖A)和100HA/l11，進行雙熒光檢測，結(jié)果以Fluc側(cè)u。表示。圖(C)為白表達。v多聚酶Pol抑制PHSCHS細胞I剛一p的產(chǎn)生HBv多聚酶Pol對肝細胞產(chǎn)生IFN一p的特異性表達質(zhì)粒(圖sB)轉(zhuǎn)染PH5eHs細胞，并以PcR結(jié)果提示，HBv多聚酶pol也以劑量依賴的的IFN一p的轉(zhuǎn)錄水平(圖SA)。以上結(jié)果進一步提

圖8HBv多聚酶Pof對PH5cHS細胞IFN一p產(chǎn)生的HSCHS細胞中共轉(zhuǎn)不同劑量的pcDNA3.卜3XFlag一o1，處理組inlPoly(I:e)和100HA角llNo、r(圖A)刺激，6h后裂解細胞，l一timePCR。圖(B)為W七stel二blot檢測不同劑量的Pol蛋白表Bv多聚酶Pol抑制PH別二RS細胞產(chǎn)生IFN一p作用區(qū)v多聚酶由末端蛋白(TP)、間隔區(qū)(spacer)、DNA聚NAPOI用汀)和RNA酶活性區(qū)(RNaseH)組成。為進一信號通路的HBv多聚酶區(qū)域，將多聚酶的不同截短HS細胞，并以NDv刺激，雙熒光結(jié)果提示，多聚酶

為進一步明確HBV蛋白對IRF一3磷酸化的影響，在PHSCHS細胞中轉(zhuǎn)染Pol、core和HBx蛋白表達質(zhì)粒，再以Poly(LC)和NDV刺激，結(jié)果提示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染Pol、Core和HBx蛋白的組RF一3磷酸化水平均無顯著差(圖12)，進一步提示了HBv不通過影響m王一3磷酸化以抑制IFN一p的產(chǎn)生。Contro!COIeI扭XM此k-‘__曬叫----人D、，~一一_任J一3一P賺.曲賺口呻口婦喇口.’h‘exPOsureIRI一3一PFlag一PolEGFP·Core卜aetin圖12轉(zhuǎn)染IIBv蛋白對腸J.3磷酸化狀態(tài)的影響pHSCHS細胞中分別轉(zhuǎn)染pel)NA3.l、peDNA3.l一 3XFlag一Pol、Eo即一eore和EGFP一HBx，36h后處理組分別以50歸歲mlpol城LC)和 100H凡 /m1NDv刺激細胞，12h后收集細胞，從怎 stemblot檢測IRF一3一P、p一ac血和各HBV蛋白的表達。
【引證文獻】

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1 謝麗平;苦參素聯(lián)合干擾素-α治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的療效與中醫(yī)證型的相關(guān)性研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2012年

本文編號：2835161