實(shí)驗(yàn)背景及目的:克羅恩病(Crohn’s disease,CD)是一種原因尚未完全闡明的慢性炎癥性肉芽腫性疾病。可侵害口腔至肛門(mén)的整個(gè)消化道,在消化道任何部位均可發(fā)病,尤其腸道最多,主要見(jiàn)于回腸末端和鄰近結(jié)腸。瘺管形成是CD的特征性臨床表現(xiàn),包括內(nèi)瘺和外瘺。內(nèi)瘺通常通向體內(nèi)其他部位,如其他腸段、輸尿管、陰道、膀胱、腸系膜、腹膜后等;外瘺是通過(guò)腹壁或者肛周皮膚,與外界相通。約25%的CD患者在疾病過(guò)程中會(huì)發(fā)生難治性的瘺管,嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種具有低免疫源性及免疫調(diào)節(jié)能力的多能干細(xì)胞,在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)中具有非常好的治療前景。因此,我們通過(guò)建立小鼠腸道-皮膚瘺管模型模擬CD患者腸-皮瘺的形成,局部應(yīng)用MSCs對(duì)其進(jìn)行干預(yù),觀察其治療效果,并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:首先我們構(gòu)建了一種可以通過(guò)小動(dòng)物活體成像技術(shù)實(shí)時(shí)追蹤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及存活的攜帶螢火蟲(chóng)熒光素酶-綠色熒光蛋白雙融合報(bào)告基因的MSCs細(xì)胞系。然后建立小鼠腸道-皮膚瘺管模型,隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PBS)對(duì)照組、MSCs治療組,每組8只。腸道-皮膚瘺瘺口局部多點(diǎn)注射移植等體積的PBS或MSCs(1×10~6個(gè)細(xì)胞)后,在不同的時(shí)間點(diǎn),通過(guò)小鼠體重下降百分比、瘺口部位宏觀表象、組織病理學(xué)技術(shù)等檢測(cè)瘺口組織的再生修復(fù)情況;通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)(bioluminescence imaging,BLI)檢測(cè)MSCs移植后在體內(nèi)的存活情況、瘺口部位活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的含量以及血管新生情況;收集瘺口組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)組織炎癥相關(guān)因子、血管新生相關(guān)因子的表達(dá);同時(shí),為了在體外條件下評(píng)價(jià)MSCs在血管形成過(guò)程中的作用,我們用MSCs培養(yǎng)后的細(xì)胞上清液處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),觀察其對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖、遷移、成管過(guò)程中的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:小鼠腸道-皮膚瘺管模型建立后,經(jīng)小動(dòng)物X光鋇劑造影顯示小鼠瘺管形成。小鼠腸-皮瘺模型形成后,局部注射MSCs或PBS緩沖液后于1,3,5,7天經(jīng)小動(dòng)物活體成像顯示,MSCs可以穩(wěn)定聚集于小鼠腸道-皮膚瘺口部位,并在瘺口部位存活約1周;與此同時(shí),MSCs治療可以降低小鼠體重下降百分比,促進(jìn)小鼠體重恢復(fù),加快小鼠瘺口部位的愈合速度;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示MSCs治療可以降低瘺口部位炎癥促進(jìn)因子表達(dá),增加炎癥抑制因子的表達(dá),抑制瘺口炎癥;并增強(qiáng)瘺口部位的血管新生相關(guān)因子的表達(dá)。生物發(fā)光成像及化學(xué)發(fā)光成像結(jié)果顯示MSCs治療組小鼠瘺口部位ROS含量下降,血管新生能力增強(qiáng),加快了小鼠瘺口的愈合。此外,在體外條件下,我們證明了MSCs上清液可以顯著促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的增殖、遷移,及成管。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:在小鼠腸道-皮膚瘺管模型中,局部應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)減少體重下降百分比,減輕組織炎癥,促進(jìn)損傷部位組織血管新生,加速腸道-皮膚瘺管的愈合。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R574
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文按照前述方法培養(yǎng)于 75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，接種約 2-3 天后，細(xì)胞融合度達(dá) 90%以上，按照前述操作步驟將細(xì)胞不斷消化、計(jì)數(shù)、傳代，直至第 10 代。結(jié)果顯示：在體外培養(yǎng)過(guò)程中，WT-P-MSCs 或 DF-P-MSCs 均具有很強(qiáng)的增殖能力，其增殖曲線成指數(shù)型（圖 1.2 C）。

圖 1.3 P-MSCs 的表型鑒定。.2 P-MSCs 局部移植2.1 腸道-皮膚瘺管模型的構(gòu)建及驗(yàn)證通過(guò)前述方法我們成功建立了小鼠腸道-皮膚瘺管模型（圖 2.1 A）。于瘺管成后第 3 天，我們通過(guò)小動(dòng)物 X 線鋇劑造影由瘺管外口向瘺管內(nèi)輸注造影劑，證腸道-皮膚瘺管是否形成。結(jié)果如圖所示：小鼠腸道-皮膚瘺管通暢，鋇劑由外可以進(jìn)入體內(nèi)腸管，說(shuō)明小鼠腸道-皮膚瘺管模型構(gòu)建成功（圖 2.1 B）。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 1.3 P-MSCs 的表型鑒定。2.2 P-MSCs 局部移植2.2.1 腸道-皮膚瘺管模型的構(gòu)建及驗(yàn)證通過(guò)前述方法我們成功建立了小鼠腸道-皮膚瘺管模型（圖 2.1 A）。于瘺管形成后第 3 天，我們通過(guò)小動(dòng)物 X 線鋇劑造影由瘺管外口向瘺管內(nèi)輸注造影劑，驗(yàn)證腸道-皮膚瘺管是否形成。結(jié)果如圖所示：小鼠腸道-皮膚瘺管通暢，鋇劑由體外可以進(jìn)入體內(nèi)腸管，說(shuō)明小鼠腸道-皮膚瘺管模型構(gòu)建成功（圖 2.1 B）。

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本文編號(hào)：2831681