研究背景和目的 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)治療的關(guān)鍵為抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治療。目前被我國國家食品藥品監(jiān)督管理局(State Foodand Drug Administration,SFDA)批準(zhǔn)用于抗HBV治療的藥物主要包括兩類:干擾素類與核苷(酸)類似物類,后者包括拉米夫定(lamivudine,LAM)、阿德福韋酯(adefovir dipivoxil,ADV)、替比夫定(telbivudine,LdT)與恩替卡韋(entecavir,ETV)。其中ADV自上市以來,在CHB患者,尤其是LAM耐藥患者中被廣泛應(yīng)用。但隨著ADV治療時間延長,ADV耐藥的問題逐漸凸顯。目前關(guān)于ADV耐藥相關(guān)的HBV反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,rt)區(qū)變異位點報道較多,如rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S、rtI233V與rtN238T/D等,但公認的ADV耐藥相關(guān)的HBV變異為rtA181V/T與rtN236T。ADV治療e抗原(HBeAg)陰性的核苷(酸)類似物初治CHB患者1～5年累積耐藥發(fā)生率分別為0%、3%、11%、18%與29%。患者出現(xiàn)ADV耐藥相關(guān)變異后,可以相繼出現(xiàn)病毒學(xué)突破、生化學(xué)突破、肝炎發(fā)作與肝功能失代償?shù)取Ｒ虼硕ㄆ诒O(jiān)測、早期發(fā)現(xiàn)ADV耐藥并給予有效的挽救治療對于有效地控制HBV感染具有重要意義。在ADV耐藥的監(jiān)測中,血清HBV DNA檢測是重要的篩查指標(biāo)。但是血清HBV DNA除受到ADV耐藥影響外,還與患者依從性、患者應(yīng)用藥物的質(zhì)量、藥物代謝因素以及體內(nèi)病毒的自然波動等相關(guān),而特異性的ADV耐藥檢測則是確診患者ADV基因型耐藥的方法。 現(xiàn)已報道的ADV基因型耐藥(genotypic resistance)的檢測方法包括:聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物直接測序法、克隆測序法、線性探針反向雜交法、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法(restriciton fragmentlength polymorphism,RFLP)、實時熒光定量PCR法與限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性(restriciton fragment mass polymorphism,RFMP)等方法。在這些方法中,實時熒光定量PCR法目前尚未應(yīng)用于臨床檢測;線性探針反向雜交法與RFMP法價格昂貴;克隆測序法操作非常繁瑣而且價格昂貴。目前國內(nèi)ADV耐藥檢測應(yīng)用最廣泛的是PCR產(chǎn)物直接測序法與PCR-RFLP法。PCR產(chǎn)物直接測序法目前多采用雙脫氧測序法(di-deoxy sequencing),其缺點為檢測敏感度較低,只有當(dāng)變異病毒占體內(nèi)病毒群20%～30%以上時方可檢出。PCR-RFLP法成本相對低廉,但僅針對已知變異,對每種變異均需設(shè)計特異性引物與酶切位點,且受到操作人員以及酶切體系影響較大。隨著ADV耐藥問題的逐漸凸顯,臨床上迫切需要有較高敏感度與特異度、操作簡便、自動化程度高并且價格相對低廉的耐藥檢測方法。 基因芯片技術(shù)用于疾病診斷具有高通量與高靈敏度的優(yōu)點,它用于LAM耐藥的檢測已有報道,檢測HBV DNA下限為2～3 log_(10)拷貝/mL,可于病毒群中檢出＞10%變異株。另外焦磷酸測序法作為一種新興的測序方法,已有報道用于LAM耐藥檢測,同樣肯有高通量與高靈敏度特點,并可于病毒群中檢出＞10%變異病毒。目前尚無基因芯片法與焦磷酸測序法檢測ADV耐藥的報道。 因此,我們收集ADV治療出現(xiàn)病毒學(xué)突破或治療48周未達到病毒學(xué)應(yīng)答的CHB患者的血清樣本與臨床資料,采用PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法、焦磷酸測序法與基因芯片法進行ADV耐藥檢測,對三種方法檢測結(jié)果進行分析。同時,我們進一步比較ADV治療病毒學(xué)突破患者與48周無病毒學(xué)應(yīng)答患者的耐藥發(fā)生情況,分析耐藥相關(guān)因素;并比較HBV基因型與ADV耐藥的相關(guān)性。具體內(nèi)容分述如下: 第一部分:慢性乙型肝炎患者阿德福韋酯耐藥的檢測方法分析 本部分實驗,我們收集ADV治療出現(xiàn)病毒學(xué)突破或48周未達到病毒學(xué)應(yīng)答患者的血清,分別應(yīng)用PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法、焦磷酸測序法與基因芯片法進行基因型耐藥檢測。對三種檢測方法的耐藥檢測結(jié)果進行分析,探討漏檢耐藥變異的原因,并對變異株在病毒群中所占比率(以下簡稱變異株比率)做初步探討。 材料和方法: 1.收集ADV治療(10mg/d)出現(xiàn)病毒學(xué)突破(病毒學(xué)突破組)或48周未達到病毒學(xué)應(yīng)答患者(病毒學(xué)失敗組)血清提取DNA模板,巢式PCR擴增后取陽性擴增的產(chǎn)物進行雙脫氧法測序,采用NTI Vector 9與Chromas軟件分析測序結(jié)果。 2.取患者血清提取DNA模板,PCR擴增后取陽性擴增的產(chǎn)物采用基因科技(上海)HBV耐藥突變焦磷酸測序法檢測試劑盒進行檢測。采用焦磷酸測序儀配套分析軟件進行變異判斷與變異株比率分析。 3.取患者血清提取DNA模板,PCR擴增后取陽性擴增的產(chǎn)物采用晶芯乙型肝炎病毒耐藥檢測基因芯片試劑盒進行檢測,檢測結(jié)果采用晶芯乙型肝炎病毒耐藥基因芯片分析軟件進行分析。 4.采用t檢驗、t′檢驗、Wilcoxon秩和檢驗、Pearson非校正法卡方檢驗或Yates校正法卡方檢驗進行統(tǒng)計分析。SPSS 11.5軟件用于統(tǒng)計計算。 結(jié)果: 1.共檢測病毒學(xué)突破組患者106例與病毒學(xué)失敗組患者104例,兩組患者性別比與平均年齡差別不存在統(tǒng)計學(xué)意義。 2.ADV耐藥檢測結(jié)果: (1).PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法耐藥檢測:210例患者PCR擴增均為陽性。病毒學(xué)突破組檢出ADV耐藥38例,病毒學(xué)失敗組檢出ADV耐藥14例。 (2).PCR產(chǎn)物焦磷酸測序法檢測:PCR擴增陰性患者10例(病毒學(xué)突破組5例,病毒學(xué)失敗組5例)。病毒學(xué)突破組檢出ADV耐藥42例,病毒學(xué)失敗組檢出ADV耐藥22例。 (3).基因芯片法檢測:PCR擴增陰性患者21例(病毒學(xué)突破組12例,病毒學(xué)失敗組9例)。病毒學(xué)突破組檢出ADV耐藥33例,病毒學(xué)失敗組檢出ADV耐藥14例。 (4).由于雙脫氧測序法與焦磷酸測序法為基于測序分析方法,其陽性結(jié)果可確認ADV耐藥。此兩種最終確定ADV耐藥患者67例,其中病毒學(xué)突破組45例,病毒學(xué)失敗組22例。共檢出ADV耐藥變異位點92個。基因芯片檢測結(jié)果均得到雙脫氧測序法和/或焦磷酸測序法的確認。 3.三種檢測方法比較: (1).檢測結(jié)果符合率:3種檢測方法完全符合率為74.8%;雙脫氧測序法與焦磷酸測序法結(jié)果符合率為83.8%;雙脫氧測序法與基因芯片法結(jié)果符合率為83.3%;另外焦磷酸測序法與基因芯片法結(jié)果符合率為81.4%。 (2).就確認的67例ADV耐藥患者對三種方法的耐藥檢出率比較:焦磷酸測序法耐藥患者(P=0.002)以及耐藥位點檢出率(P=0.002)高于雙脫氧測序法;焦磷酸測序法耐藥患者(P＜0.001)以及耐藥位點檢出率(P＜0.001)高于基因芯片法。雙脫氧測序法與基因芯片法耐藥患者(P＞0.05)與耐藥位點檢出率(P＞0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 (3).三種方法檢測結(jié)果的陽性預(yù)測值:PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法與焦磷酸測序法可直接顯示變異位點,其陽性預(yù)測值為100%。本研究中,基因芯片檢測陽性結(jié)果均得到測序法的驗證,其陽性預(yù)測值為100%。 4.漏檢變異分析: (1).PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法漏檢變異位點21個,漏檢位點與患者血清HBVDNA水平與變異株在病毒群中所占比率相關(guān)。 (2).基因芯片法共漏檢耐藥變異位點29個,漏檢位點主要與變異株的血清拷貝數(shù)相關(guān),而與變異株在病毒群中所占比率無直接相關(guān)。 (3).焦磷酸測序法共漏檢6個耐藥變異位點。漏檢位點原因尚不清。 5.檢出變異的變異株比率分析: (1).rtA181T、rtA181V與rtN236T變異各自在檢出時的平均變異株比率分別為38.96%、54.89%與54.01%。rtA181V平均變異株比率高于rtA181T(P=0.005)。rtA181V與rtN236T平均變異株比率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 (2).在病毒學(xué)突破組,單一位點變異患者共24例,其中14例患者變異株比率＜50%。在病毒學(xué)失敗組中,單一位點變異患者共20例,其中12例患者變異株比率＜50%。 結(jié)論: 1.初步研究表明,PCR產(chǎn)物焦磷酸測序法的ADV耐藥檢出率優(yōu)于雙脫氧測序法與基因芯片法。基因芯片法耐藥檢出率與雙脫氧測序法無顯著性差異。焦磷酸測序法與雙脫氧測序法檢測陽性結(jié)果可以確認耐藥,基因芯片法同樣具有較好的陽性預(yù)測值。 2.PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法漏檢變異位點與患者血清HBV DNA水平與變異株所占比率相關(guān)�；蛐酒z位點主要血清中變異株的拷貝數(shù)相關(guān),而與變異株在病毒群中所占比率無直接相關(guān)。 3.無論是ADV治療出現(xiàn)病毒學(xué)突破還是治療48周無病毒學(xué)應(yīng)答患者,其檢出的耐藥變異株在體內(nèi)均可能以非優(yōu)勢株存在,體內(nèi)變異株比率與患者HBVDNA改變的關(guān)系還有待進一步研究。 第二部分:CHB患者ADV耐藥的相關(guān)因素分析 由上部分可知,無論是ADV治療病毒學(xué)突破組患者還是病毒學(xué)失敗組患者均只有部分患者檢出耐藥。因此我們就第一部分中患者的ADV耐藥檢測結(jié)果進一步比較病毒學(xué)突破組與病毒學(xué)失敗組患者的耐藥情況,分析耐藥發(fā)生的相關(guān)因素;并分析HBV基因型與ADV耐藥的相關(guān)性。 材料與方法 1.患者HBV基因型檢測,采用巢式PCR方法擴增HBV表面抗原(HBsAg)編碼序列,擴增產(chǎn)物進行測序分析,將測序結(jié)果輸入美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)HBV分型軟件進行分型。 2.病毒學(xué)突破組與病毒學(xué)失敗組患者ADV耐藥檢測參照論文第一部分。 3.采用t檢驗、t′檢驗、Wilcoxon秩和檢驗、Pearson非校正法卡方檢驗或Yates校正法卡方檢驗進行統(tǒng)計分析。SPSS 11.5軟件用于統(tǒng)計計算。 結(jié)果: 1.病毒學(xué)突破組中基因B型患者18例,基因C型患者88例。病毒學(xué)失敗組中基因B型患者21例,基因C型患者83例。兩組均未檢出其它基因型患者。 2.兩種方法共檢出ADV耐藥患者67例,其中病毒學(xué)突破組45例,病毒學(xué)失敗組22例。共檢出耐藥變異92個,其中rtA181V/T變異63個,rtN236T變異29個。病毒學(xué)突破組耐藥患者檢出率高于病毒學(xué)失敗組(P＜0.001)。病毒學(xué)突破組聯(lián)合變異檢出率高于病毒學(xué)失敗組(P=0.013)。病毒學(xué)突破組單一rtA181T變異患者比率低于病毒學(xué)失敗組(P=0.017)。 3.病毒學(xué)突破組中,單一位點變異患者HBV DNA突破水平(P＞0.05)與生化學(xué)突破率(P＞0.05)與聯(lián)合變異患者差別無統(tǒng)計學(xué)意義。包含rtA181T變異患者HBV DNA突破水平低于不包含該變異的耐藥患者(P=0.014),但生化學(xué)突破率高于不包含該變異的耐藥患者(P=0.023)。 4.兩組患者中,基因B型與C型患者耐藥發(fā)生率差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)�；駼型ADV耐藥患者中單一rtN236T變異患者比率高于基因C型ADV耐藥患者(P=0.011)。 5.兩組患者中LAM治療失敗患者ADV耐藥檢出率均高于ADV初治患者(病毒學(xué)突破組P=0.010;病毒學(xué)失敗組P=0.020)。 結(jié)論: 1.ADV耐藥變異中,rt181V/T變異較rtN236T變異常見,無論是ADV治療病毒學(xué)突破患者還是治療48周無病毒學(xué)應(yīng)答患者均需進行耐藥檢測以指導(dǎo)抗病毒方案選擇。 2.rtA181T變異可降低ADV治療出現(xiàn)病毒學(xué)突破患者的HBV DNA升高幅度,但可增加患者生化學(xué)突破率;分析可能的原因與rtA181T變異導(dǎo)致的HBsAg變異相關(guān)。 3.基因B型ADV耐藥患者中單一rtN236T變異所占比率高于基因C型ADV耐藥患者,結(jié)果有待進一步確認。 4.無論是在病毒學(xué)突破人群還是治療48周無病毒學(xué)應(yīng)答人群,ADV耐藥均多發(fā)生于LAM經(jīng)治患者。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

芯片探針點樣采用基因芯片微量點樣技術(shù)，每種探針均重復(fù)5個點，形成gxlo的微陣列。每張芯片包括4個微陣列，即可同時檢測4份樣本。芯片的探針分布與探針說明如圖1一1與表1一4所示。粉粉瞪幽肖邏溯瞥娜梢診繆攀 攀 ................返返D誣D誣延互X函.......洲 .....口— — —@@@@@@@吵吵西吵碗瀕吵 吵吵 掃一 tttt吵吵吵吵吵吵@@@匹狄畫 )))))，’口 、 、少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少少口 、 、 、吧吧四她叢J健吧滬健絲歲‘迎歲從旦歲火燮到又竺夕氣旦少返引 引引 、 、 、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、 、廠~，一一一一-門 門(((2書N川236N)牌舀6N只2拍N雌舀6N)(236T樹236T)(2跪T日 236TI236T)))扮豐一…一 一 一

2.PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法檢測結(jié)果:210例患者均采用PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法進行檢測，所有210例患者提取血清 HBVDNA模板后ntPCR反應(yīng)均有陽性擴增(見圖1一3)。陽性擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進行測序分析。測序結(jié)果應(yīng)用 VectorNTI9.0與Chromas進行分析(圖1一4與圖1一5顯示1例患者測序分析結(jié)果)。測序結(jié)果包括TXT格式文件(附圖2)與Chromas格式文件，首先應(yīng)用 VectorNTI9.0軟件對TXT文件進行初步分析，再進一步應(yīng)用Chromas軟件分析測序峰圖以查找可能的雜合情況，并再次確認 VectorNTI9.0軟件分析結(jié)果。共檢出ADV基因型耐藥52例，其中病毒學(xué)突破組檢出38例，病毒學(xué)失敗組檢出14例(表1一8)。需注意PCR產(chǎn)物雙脫氧測序法一次反應(yīng)可給出包含rt區(qū)A一D保守區(qū)的所有序列，因此可分析現(xiàn)有所有的核普(酸)類似物的基因型耐藥情況，因本文主要為ADV基因型耐藥檢測

___){萬……自{)……………{…二……畫…〕… …弓弓一由 1bppppppppppppppppppp 44444己「 「 「圖1一 4.NTIvecto:9.0軟件分析測序結(jié)果1一4號框內(nèi)分別標(biāo)示該患者rt180、rt181、rt204與rt236位序列與編碼氨基酸，提示患者出現(xiàn) rtA18IT變異，其它位點為野生株。.T.G，亡奮.T.1-一T.TF.T.T.G.

本文編號：2830171