丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要原因之一。目前尚缺乏有效的疫苗,標(biāo)準(zhǔn)治療方案是采用干擾素(interferon,IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin,RBV),但部分患者療效不理想。影響治療效果的因素眾多,包括宿主及病毒因素等。近年研究發(fā)現(xiàn)宿主基因多態(tài)性與HCV感染轉(zhuǎn)歸相關(guān),相繼報(bào)道了人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)、IFN刺激基因和IL28B等。其中IL28B基因多態(tài)性對(duì)抗病毒治療應(yīng)答和病毒自然清除具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。然而,在攜帶有危險(xiǎn)等位基因的純合子型人群中,仍有1/3的人獲得了持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response,SVR),所以單純考慮宿主因素并不能解釋丙型肝炎抗病毒治療的療效,病毒對(duì)IFN治療的影響也同樣值得注意。 HCV編碼的多種病毒蛋白可通過影響細(xì)胞內(nèi)眾多信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而改變正常的應(yīng)答途徑導(dǎo)致IFN抵抗。相關(guān)機(jī)制研究較多,包括E2的糖基化結(jié)構(gòu)抑制干擾素介導(dǎo)的蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)通路以保護(hù)HCV不被清除;HCV NS3/4A影響干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)信號(hào)傳導(dǎo),導(dǎo)致內(nèi)源性免疫逃逸及外源性干擾素治療抵抗;HCV NS5A蛋白C端2209-2248位氨基酸殘基形成的干擾素敏感決定區(qū)(interferon sensitivity determining region,ISDR),與PKR結(jié)合后抑制PKR生物活性,但以上研究目前尚存在較大的爭(zhēng)議。近年來研究認(rèn)為HCV核心蛋白可作用于信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)家族,通過抑制JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而減少干擾素刺激基因(interferon stimulate gene,ISG)的轉(zhuǎn)錄;與核轉(zhuǎn)錄因子作用影響固有免疫應(yīng)答因子,最終降低ISG表達(dá)。這些成果為深入研究HCV核心蛋白干擾素抵抗機(jī)制提供了大量的基礎(chǔ),使HCV核心蛋白成為研究HCV致病機(jī)制和防治的熱點(diǎn)。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)HCV核心蛋白與IFN療效相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能,并通過臨床觀察研究驗(yàn)證,探討HCV核心蛋白與IFN療效相關(guān)的特征結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域中氨基酸變異及與IFN療效的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下: 一、HCV核心蛋白結(jié)構(gòu)及功能的生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 利用生物信息學(xué)工具對(duì)HCV各基因型核心蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),并預(yù)測(cè)其可能存在的功能模序,綜合分析比較HCV核心蛋白中存在的與IFN治療敏感性相關(guān)的結(jié)構(gòu)區(qū)域并分析型間差異。結(jié)果顯示: 1、HCV核心蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無規(guī)卷曲比例高而不易形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),2-45氨基酸可能存在螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 2、HCV核心蛋白16-36氨基酸可能與人解旋酶的DEAD box結(jié)構(gòu)(DDX3)結(jié)合,2-23氨基酸可能與STAT1結(jié)合,可能與IFN抵抗有關(guān)。 3、HCV核心蛋白中可能存在磷酸化等多種修飾位點(diǎn)及與SH2、SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的區(qū)域,可能調(diào)節(jié)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響IFN作用。 二、HCV核心蛋白變異與干擾素療效相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究 收集115例接受IFN聯(lián)合RBV治療的丙型肝炎患者并進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪觀察。治療前進(jìn)行HCV基因分型,并對(duì)患者血清HCV RNA進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),其中52例獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)和26例未獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(non-sustained virological response,N-SVR)的患者能成功擴(kuò)增HCV核心(Core)區(qū)全長(zhǎng)序列,對(duì)這部分患者Core區(qū)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)中與IFN治療敏感性相關(guān)的結(jié)構(gòu)區(qū)域及各型間差異的結(jié)果,并進(jìn)行氨基酸變異統(tǒng)計(jì)分析。 1、HCV Core區(qū)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)結(jié)果與第一部分相符。各基因型間氨基酸變異主要集中在1-40和70-110氨基酸區(qū)域。 2、aa4或aa91變異在SVR和N-SVR組的比較中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且Cys91變異的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 全文結(jié)論: 1、HCV核心蛋白為二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象不穩(wěn)定但可塑性好的蛋白,可能存在與DDX3和STAT等結(jié)合的區(qū)域及磷酸化、酰胺化等多種修飾位點(diǎn)和兩性蛋白SH3結(jié)構(gòu)域作用的區(qū)域。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能區(qū)域均有可能影響IFN治療效果,可能是核心蛋白抵抗IFN治療的分子基礎(chǔ)。 2、HCV核心蛋白與IFN療效相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域中存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的氨基酸變異,推測(cè)這些氨基酸變異可能作為IFN治療反應(yīng)性的預(yù)測(cè)因子。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R512.63
【部分圖文】：

圖 2 HCV 核心蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)表 3 各基因型 2-45 氨基酸替換Sitenotype Identity4 10 16 20 31 32 36 CV 1a 90.9% N/I K N Q V G L V 1b 90.9% N K N Q V G L CV 2 97.7% N K N Q/E V G L CV 3 72.7% L K/Q/I N/I/L Q/K V/Y G/V V RCV 4 N K N M/Q V G L CV 5 97.7% N K N M V G L CV 6 84.1% N/L K N Q V G L N、K、V、G、V、L、R 等分別為不同氨基酸縮寫

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文表7 RT-PCR及PCR擴(kuò)增引物引物名稱 起始位置 引物序列 長(zhǎng)度(bp)CE1-ESP nt834 GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC 26CE1-EAP nt1328 CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT 24CE1-IAP nt1316 GTTCATCATCATATCCCATGCCAT 245'UTR1 nt68 GCAGAAAGCGCCTAGCCATGGCGT 24

CE1區(qū)瓊脂糖凝膠電泳M：Marker；泳道1：CE1區(qū)PCR產(chǎn)物495bp

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本文編號(hào)：2827693