第一部分HBV編碼的反式激活蛋白調(diào)控端粒酶活性的作用及機(jī) 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染肝細(xì)胞所致急慢性肝炎及相關(guān)肝硬化、肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是危害全世界,尤其是我國(guó)人民身心健康的重要病因。深入闡明HBV致癌機(jī)制,必將為預(yù)防和控制肝癌的發(fā)生發(fā)展提供強(qiáng)有力的手段。目前HBV致癌的確切機(jī)理尚未完全清楚,但HBVDNA整合及整合后通過反式激活作用致癌的論點(diǎn)已成為大多數(shù)學(xué)者的共識(shí)。有研究表明在不同的HBV相關(guān)HCC組織中,端粒酶編碼基因內(nèi)存在HBV基因片段的整合。這些整合的HBV基因可激活人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerasereverse tramscriptase,hTERT),上調(diào)端粒酶活性,促進(jìn)肝癌的發(fā)生。 端粒酶(telomerase)位于端粒末端,是一種特殊的核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶,大多數(shù)正常體細(xì)胞不表達(dá)端粒酶活性,而在惡性腫瘤中端粒酶活性高表達(dá)。研究表明一些病毒編碼的蛋白,可通過激活端粒酶來維持端粒長(zhǎng)度,阻止細(xì)胞死亡,來促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與腫瘤的發(fā)生。 HBx與PreS2作為HBV基因編碼的兩種重要轉(zhuǎn)錄激活蛋白,在HBV相關(guān)肝癌中的整合率遠(yuǎn)大于其他蛋白,被認(rèn)為在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。而這兩種HBV基因編碼的重要轉(zhuǎn)錄激活因子,能否上調(diào)端粒酶活性,反式激活hTERT啟動(dòng)子促進(jìn)hTERT轉(zhuǎn)錄,以及通過哪些元件激活hTERT啟動(dòng)子,目前還尚未有相關(guān)報(bào)道。因此,在前期工作的基礎(chǔ)上,本課題在國(guó)內(nèi)外率先開展了有關(guān)HBV編碼反式激活蛋白調(diào)控hTERT轉(zhuǎn)錄水平的作用及機(jī)制研究,為進(jìn)一步闡明HBV感染相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。 目的: 1.研究HBx與PreS2蛋白能否促進(jìn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá),上調(diào)端粒酶活性。 2.研究HBx促進(jìn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá)的機(jī)制,篩選HBx作用于hTERT啟動(dòng)子上關(guān)鍵位點(diǎn) 3.篩選調(diào)控hTERT啟動(dòng)子的HBx關(guān)鍵區(qū)段 方法: 1.HBx及PreS2蛋白對(duì)端粒酶活性及hTERT基因表達(dá)的影響 1.1過表達(dá)HBx及PreS2蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞端粒酶活性的影響 提取pcDNA3-HBx及空載體對(duì)照pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組HepG2細(xì)胞總蛋白;提取穩(wěn)定表達(dá)preS2的HepG2肝癌細(xì)胞總蛋白;設(shè)立293細(xì)胞為端粒酶活性陽(yáng)性對(duì)照組。85℃加熱10分鐘,滅活293細(xì)胞蛋白中端粒酶活性,設(shè)為端粒酶活性陰性對(duì)照。TRAP法檢測(cè)端粒酶活性。 1.2過表達(dá)HBx及PreS2蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞hTERT基因mRNA水平表達(dá)的影響 半定量RT-PCR分別檢測(cè)pcDNA3-HBx、pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)。 半定量RT-PCR分別檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)preS2的HepG2細(xì)胞、pcDNA3空載體對(duì)照組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)。 1.3反義封閉HBx與PreS2基因表達(dá)對(duì)hTERT基因mRNA水平的調(diào)控作用 設(shè)計(jì)合成針對(duì)HBx、PreS2的硫代反義寡核苷酸PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2及無關(guān)對(duì)照硫代寡核苷酸PS-asRandom,并以陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞系,作用48h后,半定量RT-PCR分別檢測(cè)各反義寡核苷酸作用組及空細(xì)胞對(duì)照組hTERT mRNA的表達(dá)。 2.HBx對(duì)hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控作用 2.1系列缺失及突變hTERT啟動(dòng)子報(bào)告載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)、合成針對(duì)hTERT啟動(dòng)子不同片段及突變序列的特異性引物,以pCR-TRTP為模板,PCR擴(kuò)增獲得hTERT啟動(dòng)子系列缺失及突變序列的基因。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶切定向插入報(bào)告基因載體pGL3-basic內(nèi),轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109,經(jīng)抗性篩選、酶切、PCR、DNA測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性重組子。 2.2 HBx對(duì)全長(zhǎng)hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控作用 將不同劑量的重組子pcDNA3-HBx與攜帶有hTERT啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒pGL3B-TRTP共轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系,同時(shí)轉(zhuǎn)染pRL-tk作為內(nèi)參照。pGL3B-TRTP可在hTERT啟動(dòng)子的作用下表達(dá)螢火蟲熒光素酶,而pRL-tk可表達(dá)海腎熒光素酶。36h后,收集并裂解細(xì)胞,測(cè)定雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 2.3 HBx作用于hTERT啟動(dòng)子關(guān)鍵區(qū)域的尋找 將HBx表達(dá)載體與系列缺失hTERT啟動(dòng)子報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染,36h后,收集并裂解細(xì)胞,測(cè)定雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2.4 HBx作用于hTERT啟動(dòng)子關(guān)鍵位點(diǎn)的尋找 將HBx表達(dá)載體與系列突變hTERT啟動(dòng)子報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染,36h后,收集并裂解細(xì)胞,測(cè)定雙熒光素酶表達(dá)量,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2.5 HBx轉(zhuǎn)染前后對(duì)Sp1表達(dá)水平的影響 提取pcDNA-HBx及pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的各組細(xì)胞總蛋白及總RNA,Western blot及RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Sp1,HBx和β-actin的表達(dá)水平。 3.調(diào)控hTERT啟動(dòng)子的最小HBx關(guān)鍵區(qū)域的尋找 3.1截短型HBx重組子的構(gòu)建 設(shè)計(jì)、合成針對(duì)HBx不同片段基因序列的特異性引物,以pcDNA3-HBx為模板,PCR擴(kuò)增獲得HBx不同截短片段的基因。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶切定向克隆入雙酶切的pcDNA3-HBx載體內(nèi),轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)抗性篩選、酶切、PCR及DNA測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性重組子。 3.2截短型HBx在細(xì)胞中的表達(dá) 系列截短型HBx重組子經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系,48小時(shí)后,抽提各組細(xì)胞總蛋白與總RNA,Western blot或RT-PCR檢測(cè)截短型HBx的表達(dá)情況。 3.3系列截短型HBx對(duì)端粒酶啟動(dòng)子的作用 將系列截短型HBx重組子與攜帶有hTERT啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒pGL3B-TRTP共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2,同時(shí)轉(zhuǎn)染pRL-tk作為內(nèi)參照。36h后,收集并裂解細(xì)胞,測(cè)定雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 1.HBx及PreS2蛋白上調(diào)hTERT mRNA表達(dá),促進(jìn)端粒酶活性 1.1過表達(dá)HBx及PreS2蛋白上調(diào)端粒酶活性 TRAP實(shí)驗(yàn)顯示,在各組細(xì)胞中均檢測(cè)到36bp的內(nèi)參條帶,且條帶亮度均一。這說明PCR過程中,Taq酶活性正常,上樣量一致。陽(yáng)性對(duì)照組293細(xì)胞出現(xiàn)相差6bp的DNA梯形條帶,而在陰性對(duì)照組,未見梯形條帶。穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有PreS2或HBx的細(xì)胞中DNA梯形條帶增多,強(qiáng)度增強(qiáng),說明HBx及PreS2蛋白過表達(dá)可上調(diào)端粒酶活性。 1.2過表達(dá)HBx及PreS2蛋白促進(jìn)hTERT基因mRNA表達(dá) 半定量RT-PCR結(jié)果顯示,表達(dá)有PreS2或HBx的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞相比,hTERT基因mRNA水平明顯上調(diào)(P＜0.05)。 1.3反義封閉HBx與PreS2基因下調(diào)hTERT基因mRNA表達(dá) 半定量RT-PCR結(jié)果顯示,反義寡核苷酸PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2能分別有效抑制HBx與PreS2基因的表達(dá)。在不影響β-actin基因片段表達(dá)的情況下,反義封閉HBx與PreS2基因均可以下調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)。 2.HBx通過Sp1結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮激活hTERT啟動(dòng)子作用 2.1成功構(gòu)建系列缺失與突變型hTERT啟動(dòng)子報(bào)告載體 PCR成功擴(kuò)增系列缺失與突變型hTERT啟動(dòng)子基因片段,酶切、連接構(gòu)建重組報(bào)告載體,并成功轉(zhuǎn)化宿主菌,經(jīng)抗性篩選、酶切鑒定、DNA測(cè)序分析獲得陽(yáng)性重組報(bào)告載體。 2.2 HBx可反式激活全長(zhǎng)hTERT啟動(dòng)子 共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)顯示,重組子pCDNA3-HBx作用下的pGL3B-TRTP熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度較空質(zhì)粒pcDNA3作用組明顯升高,約1.5倍左右(p＜0.05)。HBx對(duì)pGL3B-TRTP的激活作用具有劑量依賴性,Western-blot檢測(cè)顯示,隨著轉(zhuǎn)染pCDNA3-HBx表達(dá)載體劑量的增加,HBx蛋白表達(dá)增加,Actin表達(dá)沒有明顯變化,但雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)顯示熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度增加。pcDNA3-HBx對(duì)pGL3B-TRTP激活作用同樣可以在其他三種細(xì)胞系Bel7402,SMMC-7721,Cos-7中檢測(cè)到,說明HBx可以反式激活不同細(xì)胞中的hTERT啟動(dòng)子。 2.3 HBx反式激活hTERT的關(guān)鍵區(qū)段是啟動(dòng)子-197～+37bp 共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)顯示,重組子pCDNA3-HBx作用下的pGL3B-TRTP,pGL3B-895,pGL3B-445,pGL3B-371,pGL3B-306,pGL3B-197報(bào)告質(zhì)粒,其相對(duì)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度比pcDNA3作用下的表達(dá)強(qiáng)度分別增加1.45倍,1.40倍,1.46倍,1.38倍,1.58倍與1.38倍。而hTERT啟動(dòng)子5'端缺失到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游37bp時(shí),HBx誘導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度消失。這說明HBx通過hTERT啟動(dòng)子-197～+37區(qū)域促進(jìn)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。 2.4 HBx通過hTERT啟動(dòng)子上Sp1結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮激活作用 -197～+37區(qū)域內(nèi)存在5個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)和2個(gè)C-myc結(jié)合位點(diǎn)。為研究Sp1及C-myc在HBx反式激活hTERT啟動(dòng)子中的作用,構(gòu)建Sp1結(jié)合位點(diǎn)、C-myc結(jié)合位點(diǎn)突變的hTERT啟動(dòng)子系列突變報(bào)告質(zhì)粒,并分別與HBx表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示,當(dāng)單獨(dú)或聯(lián)合突變C-myc結(jié)合位點(diǎn)時(shí),HBx仍可以促進(jìn)hTERT啟動(dòng)子作用下的熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度,說明HBx不是通過C-myc結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮反式激活作用。當(dāng)突變了Sp1結(jié)合位點(diǎn)2,4,5位時(shí),HBx作用于hTERT啟動(dòng)子的熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度減弱,與pcDNA3作用組沒有明顯差異(P＞0.05),說明Sp1結(jié)合位點(diǎn)2,4,5位在HBx反式激活hTERT啟動(dòng)子活性中發(fā)揮重要作用。 2.5 HBx沒有改變Sp1表達(dá)水平 Western blot結(jié)果,經(jīng)光密度軟件分析,計(jì)算Sp1蛋白水平的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度,結(jié)果顯示,pcDNA3-HBx轉(zhuǎn)染組與pcDNA3轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞組相比,Spl蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度無顯著性差異(P＞0.05)。 半定量RT-PCR結(jié)果顯示,HBx轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞,Sp1 mRNA表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞相比無顯著差異(P＞0.05)。 3.激活hTERT啟動(dòng)子的最小HBx基因片段為50-140aa 3.1成功構(gòu)建系列截短型HBx表達(dá)載體 PCR成功擴(kuò)增系列截短型HBx基因片段,酶切、連接構(gòu)建重組表達(dá)載體,并成功轉(zhuǎn)化宿主菌,經(jīng)抗性篩選、酶切、PCR、DNA測(cè)序分析獲得陽(yáng)性重組子。 3.2系列截短型HBx可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染有不同截短型HBx肝癌細(xì)胞內(nèi),可擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)分子量的DNA條帶,而在轉(zhuǎn)染pcDNA3的HepG2細(xì)胞中沒有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。Western-blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染有不同截短型HBx肝癌細(xì)胞內(nèi),均見較強(qiáng)的actin蛋白表達(dá),而系列截短型HBx僅檢測(cè)到TC-2、TC-3、HBX、TCN和TN-1在肝癌細(xì)胞HepG2中的表達(dá),未檢測(cè)到TC-1與TN-2在肝癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá),這與TC-1、TN-2蛋白分子量較小有關(guān)。在轉(zhuǎn)染pcDNA3的HepG2細(xì)胞中沒有檢測(cè)到HBx截短型蛋白的表達(dá)。 3.3系列截短型HBx對(duì)端粒酶啟動(dòng)子的作用 共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)顯示,當(dāng)羧基端缺失14個(gè)氨基酸時(shí),即TC-3,HBx仍具有反式激活hTERT啟動(dòng)子作用,當(dāng)缺失24個(gè)氨基酸時(shí),甚或缺失104個(gè)氨基酸時(shí),其反式激活作用消失。當(dāng)氨基端缺失50個(gè)氨基酸時(shí),即TN-1,截短HBx仍具有反式激活hTERT啟動(dòng)子作用,但缺失97個(gè)氨基酸時(shí),其作用消失。同時(shí)在構(gòu)建的TCN重組載體中也驗(yàn)證了當(dāng)缺失氨基端前50個(gè)氨基酸及羧基端14個(gè)氨基酸時(shí),截短型HBx仍具有激活hTERT啟動(dòng)子作用,這說明HBx反式激活hTERT啟動(dòng)子的關(guān)鍵區(qū)段在50-140氨基酸區(qū)域內(nèi)。 結(jié)論 1.通過過表達(dá)及反義封閉實(shí)驗(yàn),證實(shí)HBx及PreS2蛋白均可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá),上調(diào)端粒酶活性。 2.HBx在不同細(xì)胞系以劑量依賴的方式激活hTERT啟動(dòng)子活性。 3.HBx通過hTERT啟動(dòng)子-197～+37激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 4.HBx通過Sp1結(jié)合位點(diǎn),而不是C-myc結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮激活hTERT啟動(dòng)子的作用。 5.研究不同的截短型HBx對(duì)hTERT啟動(dòng)子的作用,初步找到激活hTERT啟動(dòng)子的HBx關(guān)鍵區(qū)段在50～140aa區(qū)域內(nèi)。 意義 該課題的完成不僅為HBV相關(guān)HCC機(jī)制的闡明提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為端粒酶調(diào)控研究提供新思路,并為HBV相關(guān)HCC的治療提供新的靶點(diǎn),具有良好的應(yīng)用前景。 α白蛋白(a-albumin,又名afamin，簡(jiǎn)稱AFM)是第四個(gè)被鑒定的白蛋白家族成員，該家族成員還包含其他三種蛋白：白蛋白(albumin，簡(jiǎn)稱Alb)，甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)，以及維他命D結(jié)合蛋白(Vitamin D-binding protein，DBP)。白蛋白家族成員的編碼基因均位于人類第四對(duì)染色體的4q11．q22區(qū)域或小鼠第十四對(duì)染色體上，編碼蛋白具有相同的框架結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)運(yùn)血清蛋白中發(fā)揮重要的作用，主要在肝組織中表達(dá)。但這四個(gè)家族成員在肝臟的發(fā)育過程有不同的表達(dá)形式，因而白蛋白家族是研究肝臟特異性基因表達(dá)調(diào)控的重要模型。有研究表明AFP及AFM參與肝癌的發(fā)生。目前眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)詳細(xì)研究了如何在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Alb、AFP與DBP基因的表達(dá)，而關(guān)于如何調(diào)控AFM基因的表達(dá)，研究尚少。 該課題在前期研究的基礎(chǔ)上，率先分析了AFM基因啟動(dòng)子活性調(diào)控區(qū)域，為揭示α白蛋白在肝臟發(fā)育過程的調(diào)控機(jī)制及肝癌發(fā)生機(jī)制提供新的思路。 目的： 1．分析AFM基因啟動(dòng)子活性區(qū)域 2．尋找并研究調(diào)控AFM基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子 方法： 1．AFM基因啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建與活性分析 分別用雙酶切和PCR方法從載體mAFM-LacZ上獲得全長(zhǎng)與系列缺失或突變的小鼠AFM基因啟動(dòng)子序列，分別克隆到pGL3-basic多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建含有AFM啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒。重組子經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定。將重組子分別轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞系Hep3B，HepG2及HEK293細(xì)胞，通過檢測(cè)雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，評(píng)估不同的報(bào)告質(zhì)粒中AFM啟動(dòng)子活性。 2．轉(zhuǎn)錄因子HNFl對(duì)AFM啟動(dòng)子的調(diào)控作用 將不同劑量的HNFl真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HNFlQ或pcDNA3-HNFlB單獨(dú)與AFM啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-mAFM共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pRL-CMV作為內(nèi)參照，檢測(cè)雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 3．轉(zhuǎn)錄因子HNF1對(duì)突變型AFM啟動(dòng)子的調(diào)控作用 將0．1μg的HNF1真核表達(dá)質(zhì)粒peDNA3-HNF1α或pcDNA3-HNF1β單獨(dú)與不同突變型AFM啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測(cè)雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 4．轉(zhuǎn)錄因子HNF1α與HNF1β聯(lián)合對(duì)AFM啟動(dòng)子的調(diào)控作用 將不同劑量的HNF1β表達(dá)載體pcDNA3-HNF1β與0．1μg的HNF1α表達(dá)載體pcDNA3-HNFl 0【聯(lián)合與AFM啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-mAFM共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測(cè)雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 5．EMSA分析轉(zhuǎn)錄因子HNFI與AFM啟動(dòng)子相互作用研究 針對(duì)TESS軟件分析得到的AFM啟動(dòng)子上兩個(gè)HNFl結(jié)合位點(diǎn)site1及site2(-145及-75處)，設(shè)計(jì)合成分別攜帶野生型和突變型HNF1反應(yīng)元件的探針，利用Hep3B與轉(zhuǎn)染有pcDNA3-HNF1α或peDNA3-HNF1β質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞核提取物，EMSA分析轉(zhuǎn)錄因子HNFl與AFM啟動(dòng)子序列結(jié)合情況。 6．轉(zhuǎn)錄因子C／EBP對(duì)AFM啟動(dòng)子的調(diào)控作用 將C／EBP真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-CEBPa或／和pcDNA3-CEBPp單獨(dú)或聯(lián)合與AFM啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-mAFM共轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，檢測(cè)雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建AFM基因啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒 經(jīng)測(cè)序證明成功構(gòu)建了小鼠系列缺失與突變AFM啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)顯示，pGL3-mAFM在Hep3B與HepG2中熒光表達(dá)量分別為54．91±3．60與6．70±o．08，而在人胚腎細(xì)胞系HEK293中所構(gòu)建重組子熒光素表達(dá)極低2．43±0．17，說明所構(gòu)建的載體pGL3-mAFM具有特異性的AFM啟動(dòng)子活性。缺失型報(bào)告載體pGL3-248與pGL3．158的熒光素酶隨著缺失序列的增加，表達(dá)強(qiáng)度略有減少，但當(dāng)缺失了從-158～-138之間的序列，pGL3-138熒光素酶相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度明顯下降，下降約90％左右；突變載體pGL3-HNF l mtl熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度同樣下降90％左右。突變載體pGL3-HNF1mt2熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度下降50％左右，當(dāng)聯(lián)合突變HNF1兩個(gè)結(jié)合序列時(shí)，pGL3-HNF1mt12熒光素酶強(qiáng)度基本消失，說明轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游336bp序列是AFM啟動(dòng)子核心序列，HNF-1結(jié)合位點(diǎn)是維持AFM啟動(dòng)子活性重要元件。 2．轉(zhuǎn)錄因子NNF1對(duì)AFM啟動(dòng)子的激活作用 HNF1表達(dá)載體pcDNA3-HNF1α或pcDNA3-HNF1β單獨(dú)與PGL3-mAFM報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染，隨著HNF1α或HNF1β劑量的增加，AFM啟動(dòng)子作用下的熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，但HNF1β的激活作用僅為HNF1α作用的10％左右。 3．轉(zhuǎn)錄因子HNF1對(duì)突變型AFM啟動(dòng)子的激活作用 HNF1表達(dá)載體pcDNA3-HNF1α或pcDNA3-HNF1β單獨(dú)作用于突變型AFM表達(dá)載體時(shí)，結(jié)果顯示，當(dāng)單獨(dú)突變sitel或site2結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，HNFla作用下的轉(zhuǎn)錄活性相比野生型AFM啟動(dòng)子組分別下降50％與40％左右；當(dāng)單獨(dú)突變sffel結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，HNF1β作用下的突變型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性較野生型AFM轉(zhuǎn)錄活性未見改變，而突變site2結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，HNF1β作用下的轉(zhuǎn)錄活性較野生型AFM下降50％。說明HNF1α轉(zhuǎn)錄因子可通過Site1及site2發(fā)揮激活啟動(dòng)子作用，而HNF1β主要通過site2發(fā)揮激活A(yù)FM啟動(dòng)子作用。當(dāng)同時(shí)突變sitel及site2位點(diǎn)時(shí)，HNF1α或HNF1β作用下的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，與pGL3-basic相比，HNF1α或HNF1β對(duì)雙突變pGL3-HNF1mt12仍有弱的激活作用，提示在AFM啟動(dòng)子區(qū)域存在其他弱的HNF1結(jié)合位點(diǎn)。 4．轉(zhuǎn)錄因子HNF1β抑制HNF1α激活A(yù)FM啟動(dòng)子作用 轉(zhuǎn)錄因子HNF1α與HNF1β表達(dá)載體與AFM啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示隨著HNF1β劑量的增加，HNF1α作用下的AFM轉(zhuǎn)錄活性逐漸下降。 5．AFM基因啟動(dòng)子區(qū)HNF1反應(yīng)元件與蛋白相互作用分析 EMSA結(jié)果顯示，AFM啟動(dòng)子上兩個(gè)HNF1結(jié)合位點(diǎn)(site1與site2)都可與核提取物中HNF1α與HNF1β蛋白形成復(fù)合物結(jié)合條帶。自身非標(biāo)記序列競(jìng)爭(zhēng)探針使目的條帶完全消失，以突變的Site1與Site2非標(biāo)記序列競(jìng)爭(zhēng)探針，蛋白DNA結(jié)合復(fù)合物條帶不變。為了分析site1與site2與HNF1蛋白結(jié)合能力的強(qiáng)弱，以非標(biāo)記的不同劑量的β-fibrinogen，site1與site2序列競(jìng)爭(zhēng)β-fibrinogen標(biāo)記探針，EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述各序列與HNF1結(jié)合能力強(qiáng)弱為：β-fibrinogensite1site2。 6．轉(zhuǎn)錄因子C/EBP不能調(diào)控AFM啟動(dòng)子活性 轉(zhuǎn)錄因子C／EBP表達(dá)載體與攜帶有AFM啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒pGL3-mAFM共轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞系。雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，peDNA3-C／EBPα或pcDNA3-C／EBPβ單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染，未改變AFM啟動(dòng)子作用下的熒光素酶強(qiáng)度。 結(jié)論： 1．軟件分析及缺失報(bào)告基因分析，發(fā)現(xiàn)AFM基因啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-336bp～0處。 2．AFM啟動(dòng)子-145處及-75處的HNF1結(jié)合位點(diǎn)是AFM啟動(dòng)子的重要組成元件，且site1較site2在AFM啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性中發(fā)揮更重要的作用。 3．EMSA結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄因子HNF1α與HNF1β可直接結(jié)合在AFM啟動(dòng)子上兩個(gè)HNF1結(jié)合位點(diǎn)處，雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)提示轉(zhuǎn)錄因子HNF1α與HNF1β發(fā)揮反式激活作用。 4．轉(zhuǎn)錄因子HNF1α與HNF1β在維持AFM啟動(dòng)子活性中發(fā)揮重要作用，且HNF1β可以抑制HNF1α激活A(yù)FM啟動(dòng)子作用。 5．轉(zhuǎn)錄因子C／EBP不能激活A(yù)FM啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。 本研究深入探討了AFM基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為闡明肝特異性基因調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為探索肝臟發(fā)育及肝癌發(fā)生提供了新的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

p一197，F(xiàn)igZ一3TheamPPCRM:DNAmark1:P一197fragm2:P+37fragm圖2一4dell97，del一97emyemtFigZ一4’TheamPdel19withM:DNAmark

山東大學(xué)博士學(xué)位論文 2345678910圖2一 7pGL3B一dell97與pGL3B一dell97C卿emt鑒定圖FigZ一 7IdeniifieationofrePorterPlasmidPGL3B一 del197andPGL3B一 dell97Cmyemt 1.PGL3B一 dell97Plamid 2.PGL3B一 del197digestedwithMlul 3.PGL3B一 dell97digestedwithHindlll 4.PGL3B一 del197identifieation誠(chéng) thPCR 5.2000markCr 6.15000marker 7.PGL3B一 dell97CmyemtPlasmid 8.PGL3B一 dell97CmyemtdigestedwithMlul 9.PGL3B一 dell97CmyemtdigestedwithHindlll10.PGL3B一 dell97CmyemtideniifieationwithPCR圖2一8報(bào)告質(zhì)粒pGL3B一 del197Cmyemtl和pGL3B一 dell97CmyemtZ鑒定圖FigZ一 8IdeniificationofrePortPlasmidPGL3B一 dell97CmyemtlandPGL3B一 dell97CmyemtZ 1.PGL3B一 dell97Cmyemtldigestedwith KPn1andHindlll 2.PGL3B一 dell97CmyemtZdigestedwith KPn1andHindlll M20O0marker圖2一9報(bào)告質(zhì)粒pGL3B一dell32，PGL3B一 dell32mtl，PGL3B一 dell32mtZ鑒定圖FigZ一 9IdentifieationofreeomblnantorofPGL3B一dell32，PGL3B一 dell32mtl，PGL3B一 del132mtZ M2000marker 1.PGL3B一 dell32identifieation初 thPCR 2.PGL3B一 dell32mtlidentifieationwithPCR 3.PGL3B一 dell32mtZideniifieation誠(chéng)

pGL3一19FigZ一16Sequeneing以以盯戊氣〔，翻丫cl袱嘆.，_認(rèn)介t以“‘六叮拼飯自

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 魏春山;葉下珠及其復(fù)方對(duì)HBx介導(dǎo)肝癌VEGFR3表達(dá)的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2827149