第一部分HBV編碼的反式激活蛋白調控端粒酶活性的作用及機 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染肝細胞所致急慢性肝炎及相關肝硬化、肝細胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是危害全世界,尤其是我國人民身心健康的重要病因。深入闡明HBV致癌機制,必將為預防和控制肝癌的發(fā)生發(fā)展提供強有力的手段。目前HBV致癌的確切機理尚未完全清楚,但HBVDNA整合及整合后通過反式激活作用致癌的論點已成為大多數(shù)學者的共識。有研究表明在不同的HBV相關HCC組織中,端粒酶編碼基因內存在HBV基因片段的整合。這些整合的HBV基因可激活人端粒酶逆轉錄酶(human telomerasereverse tramscriptase,hTERT),上調端粒酶活性,促進肝癌的發(fā)生。 端粒酶(telomerase)位于端粒末端,是一種特殊的核糖核蛋白逆轉錄酶,大多數(shù)正常體細胞不表達端粒酶活性,而在惡性腫瘤中端粒酶活性高表達。研究表明一些病毒編碼的蛋白,可通過激活端粒酶來維持端粒長度,阻止細胞死亡,來促進細胞的轉化與腫瘤的發(fā)生。 HBx與PreS2作為HBV基因編碼的兩種重要轉錄激活蛋白,在HBV相關肝癌中的整合率遠大于其他蛋白,被認為在HBV相關肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。而這兩種HBV基因編碼的重要轉錄激活因子,能否上調端粒酶活性,反式激活hTERT啟動子促進hTERT轉錄,以及通過哪些元件激活hTERT啟動子,目前還尚未有相關報道。因此,在前期工作的基礎上,本課題在國內外率先開展了有關HBV編碼反式激活蛋白調控hTERT轉錄水平的作用及機制研究,為進一步闡明HBV感染相關疾病的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。 目的: 1.研究HBx與PreS2蛋白能否促進端粒酶逆轉錄酶表達,上調端粒酶活性。 2.研究HBx促進端粒酶逆轉錄酶基因表達的機制,篩選HBx作用于hTERT啟動子上關鍵位點 3.篩選調控hTERT啟動子的HBx關鍵區(qū)段 方法: 1.HBx及PreS2蛋白對端粒酶活性及hTERT基因表達的影響 1.1過表達HBx及PreS2蛋白對肝癌細胞端粒酶活性的影響 提取pcDNA3-HBx及空載體對照pcDNA3瞬時轉染細胞與未轉染對照組HepG2細胞總蛋白;提取穩(wěn)定表達preS2的HepG2肝癌細胞總蛋白;設立293細胞為端粒酶活性陽性對照組。85℃加熱10分鐘,滅活293細胞蛋白中端粒酶活性,設為端粒酶活性陰性對照。TRAP法檢測端粒酶活性。 1.2過表達HBx及PreS2蛋白對肝癌細胞hTERT基因mRNA水平表達的影響 半定量RT-PCR分別檢測pcDNA3-HBx、pcDNA3瞬時轉染及未轉染HepG2細胞中hTERT mRNA的表達。 半定量RT-PCR分別檢測穩(wěn)定表達preS2的HepG2細胞、pcDNA3空載體對照組細胞及未轉染HepG2細胞中hTERT mRNA的表達。 1.3反義封閉HBx與PreS2基因表達對hTERT基因mRNA水平的調控作用 設計合成針對HBx、PreS2的硫代反義寡核苷酸PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2及無關對照硫代寡核苷酸PS-asRandom,并以陽離子脂質體介導的方式分別瞬時轉染HepG2.2.15細胞系,作用48h后,半定量RT-PCR分別檢測各反義寡核苷酸作用組及空細胞對照組hTERT mRNA的表達。 2.HBx對hTERT啟動子的調控作用 2.1系列缺失及突變hTERT啟動子報告載體的構建 設計、合成針對hTERT啟動子不同片段及突變序列的特異性引物,以pCR-TRTP為模板,PCR擴增獲得hTERT啟動子系列缺失及突變序列的基因。PCR反應產物經(jīng)酶切定向插入報告基因載體pGL3-basic內,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109,經(jīng)抗性篩選、酶切、PCR、DNA測序鑒定獲得陽性重組子。 2.2 HBx對全長hTERT啟動子的調控作用 將不同劑量的重組子pcDNA3-HBx與攜帶有hTERT啟動子的報告質粒pGL3B-TRTP共轉染不同細胞系,同時轉染pRL-tk作為內參照。pGL3B-TRTP可在hTERT啟動子的作用下表達螢火蟲熒光素酶,而pRL-tk可表達海腎熒光素酶。36h后,收集并裂解細胞,測定雙熒光素酶表達強度,結果進行統(tǒng)計學分析,以均值±標準差表示。 2.3 HBx作用于hTERT啟動子關鍵區(qū)域的尋找 將HBx表達載體與系列缺失hTERT啟動子報告載體共轉染,36h后,收集并裂解細胞,測定雙熒光素酶表達強度,結果進行統(tǒng)計學分析。 2.4 HBx作用于hTERT啟動子關鍵位點的尋找 將HBx表達載體與系列突變hTERT啟動子報告載體共轉染,36h后,收集并裂解細胞,測定雙熒光素酶表達量,結果進行統(tǒng)計學分析。 2.5 HBx轉染前后對Sp1表達水平的影響 提取pcDNA-HBx及pcDNA3瞬時轉染與未轉染HepG2細胞的各組細胞總蛋白及總RNA,Western blot及RT-PCR檢測各組細胞中Sp1,HBx和β-actin的表達水平。 3.調控hTERT啟動子的最小HBx關鍵區(qū)域的尋找 3.1截短型HBx重組子的構建 設計、合成針對HBx不同片段基因序列的特異性引物,以pcDNA3-HBx為模板,PCR擴增獲得HBx不同截短片段的基因。PCR反應產物經(jīng)酶切定向克隆入雙酶切的pcDNA3-HBx載體內,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,經(jīng)抗性篩選、酶切、PCR及DNA測序鑒定獲得陽性重組子。 3.2截短型HBx在細胞中的表達 系列截短型HBx重組子經(jīng)脂質體包裹轉染HepG2細胞系,48小時后,抽提各組細胞總蛋白與總RNA,Western blot或RT-PCR檢測截短型HBx的表達情況。 3.3系列截短型HBx對端粒酶啟動子的作用 將系列截短型HBx重組子與攜帶有hTERT啟動子的報告質粒pGL3B-TRTP共轉染肝癌細胞系HepG2,同時轉染pRL-tk作為內參照。36h后,收集并裂解細胞,測定雙熒光素酶表達強度,結果進行統(tǒng)計學分析。 結果 1.HBx及PreS2蛋白上調hTERT mRNA表達,促進端粒酶活性 1.1過表達HBx及PreS2蛋白上調端粒酶活性 TRAP實驗顯示,在各組細胞中均檢測到36bp的內參條帶,且條帶亮度均一。這說明PCR過程中,Taq酶活性正常,上樣量一致。陽性對照組293細胞出現(xiàn)相差6bp的DNA梯形條帶,而在陰性對照組,未見梯形條帶。穩(wěn)定或瞬時轉染有PreS2或HBx的細胞中DNA梯形條帶增多,強度增強,說明HBx及PreS2蛋白過表達可上調端粒酶活性。 1.2過表達HBx及PreS2蛋白促進hTERT基因mRNA表達 半定量RT-PCR結果顯示,表達有PreS2或HBx的細胞和對照組細胞相比,hTERT基因mRNA水平明顯上調(P＜0.05)。 1.3反義封閉HBx與PreS2基因下調hTERT基因mRNA表達 半定量RT-PCR結果顯示,反義寡核苷酸PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2能分別有效抑制HBx與PreS2基因的表達。在不影響β-actin基因片段表達的情況下,反義封閉HBx與PreS2基因均可以下調HepG2.2.15細胞中hTERT mRNA的表達。 2.HBx通過Sp1結合位點發(fā)揮激活hTERT啟動子作用 2.1成功構建系列缺失與突變型hTERT啟動子報告載體 PCR成功擴增系列缺失與突變型hTERT啟動子基因片段,酶切、連接構建重組報告載體,并成功轉化宿主菌,經(jīng)抗性篩選、酶切鑒定、DNA測序分析獲得陽性重組報告載體。 2.2 HBx可反式激活全長hTERT啟動子 共轉染及雙熒光檢測系統(tǒng)顯示,重組子pCDNA3-HBx作用下的pGL3B-TRTP熒光素酶表達強度較空質粒pcDNA3作用組明顯升高,約1.5倍左右(p＜0.05)。HBx對pGL3B-TRTP的激活作用具有劑量依賴性,Western-blot檢測顯示,隨著轉染pCDNA3-HBx表達載體劑量的增加,HBx蛋白表達增加,Actin表達沒有明顯變化,但雙熒光檢測系統(tǒng)顯示熒光素酶表達強度增加。pcDNA3-HBx對pGL3B-TRTP激活作用同樣可以在其他三種細胞系Bel7402,SMMC-7721,Cos-7中檢測到,說明HBx可以反式激活不同細胞中的hTERT啟動子。 2.3 HBx反式激活hTERT的關鍵區(qū)段是啟動子-197～+37bp 共轉染及雙熒光檢測系統(tǒng)顯示,重組子pCDNA3-HBx作用下的pGL3B-TRTP,pGL3B-895,pGL3B-445,pGL3B-371,pGL3B-306,pGL3B-197報告質粒,其相對熒光素酶表達強度比pcDNA3作用下的表達強度分別增加1.45倍,1.40倍,1.46倍,1.38倍,1.58倍與1.38倍。而hTERT啟動子5'端缺失到轉錄起始點下游37bp時,HBx誘導的熒光素酶表達強度消失。這說明HBx通過hTERT啟動子-197～+37區(qū)域促進啟動子轉錄。 2.4 HBx通過hTERT啟動子上Sp1結合位點發(fā)揮激活作用 -197～+37區(qū)域內存在5個Sp1結合位點和2個C-myc結合位點。為研究Sp1及C-myc在HBx反式激活hTERT啟動子中的作用,構建Sp1結合位點、C-myc結合位點突變的hTERT啟動子系列突變報告質粒,并分別與HBx表達載體共轉染,結果顯示,當單獨或聯(lián)合突變C-myc結合位點時,HBx仍可以促進hTERT啟動子作用下的熒光素酶表達強度,說明HBx不是通過C-myc結合位點發(fā)揮反式激活作用。當突變了Sp1結合位點2,4,5位時,HBx作用于hTERT啟動子的熒光素酶表達強度減弱,與pcDNA3作用組沒有明顯差異(P＞0.05),說明Sp1結合位點2,4,5位在HBx反式激活hTERT啟動子活性中發(fā)揮重要作用。 2.5 HBx沒有改變Sp1表達水平 Western blot結果,經(jīng)光密度軟件分析,計算Sp1蛋白水平的相對表達強度,結果顯示,pcDNA3-HBx轉染組與pcDNA3轉染組及未轉染HepG2細胞組相比,Spl蛋白相對表達強度無顯著性差異(P＞0.05)。 半定量RT-PCR結果顯示,HBx轉染后的HepG2細胞,Sp1 mRNA表達水平與未轉染HepG2細胞相比無顯著差異(P＞0.05)。 3.激活hTERT啟動子的最小HBx基因片段為50-140aa 3.1成功構建系列截短型HBx表達載體 PCR成功擴增系列截短型HBx基因片段,酶切、連接構建重組表達載體,并成功轉化宿主菌,經(jīng)抗性篩選、酶切、PCR、DNA測序分析獲得陽性重組子。 3.2系列截短型HBx可在細胞內表達 RT-PCR結果顯示,轉染有不同截短型HBx肝癌細胞內,可擴增出對應分子量的DNA條帶,而在轉染pcDNA3的HepG2細胞中沒有特異性擴增產物。Western-blot結果顯示,轉染有不同截短型HBx肝癌細胞內,均見較強的actin蛋白表達,而系列截短型HBx僅檢測到TC-2、TC-3、HBX、TCN和TN-1在肝癌細胞HepG2中的表達,未檢測到TC-1與TN-2在肝癌細胞中的蛋白表達,這與TC-1、TN-2蛋白分子量較小有關。在轉染pcDNA3的HepG2細胞中沒有檢測到HBx截短型蛋白的表達。 3.3系列截短型HBx對端粒酶啟動子的作用 共轉染及雙熒光檢測系統(tǒng)顯示,當羧基端缺失14個氨基酸時,即TC-3,HBx仍具有反式激活hTERT啟動子作用,當缺失24個氨基酸時,甚或缺失104個氨基酸時,其反式激活作用消失。當氨基端缺失50個氨基酸時,即TN-1,截短HBx仍具有反式激活hTERT啟動子作用,但缺失97個氨基酸時,其作用消失。同時在構建的TCN重組載體中也驗證了當缺失氨基端前50個氨基酸及羧基端14個氨基酸時,截短型HBx仍具有激活hTERT啟動子作用,這說明HBx反式激活hTERT啟動子的關鍵區(qū)段在50-140氨基酸區(qū)域內。 結論 1.通過過表達及反義封閉實驗,證實HBx及PreS2蛋白均可以促進肝癌細胞中hTERT mRNA表達,上調端粒酶活性。 2.HBx在不同細胞系以劑量依賴的方式激活hTERT啟動子活性。 3.HBx通過hTERT啟動子-197～+37激活其轉錄表達。 4.HBx通過Sp1結合位點,而不是C-myc結合位點發(fā)揮激活hTERT啟動子的作用。 5.研究不同的截短型HBx對hTERT啟動子的作用,初步找到激活hTERT啟動子的HBx關鍵區(qū)段在50～140aa區(qū)域內。 意義 該課題的完成不僅為HBV相關HCC機制的闡明提供了新的實驗依據(jù),為端粒酶調控研究提供新思路,并為HBV相關HCC的治療提供新的靶點,具有良好的應用前景。 α白蛋白(a-albumin,又名afamin，簡稱AFM)是第四個被鑒定的白蛋白家族成員，該家族成員還包含其他三種蛋白：白蛋白(albumin，簡稱Alb)，甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)，以及維他命D結合蛋白(Vitamin D-binding protein，DBP)。白蛋白家族成員的編碼基因均位于人類第四對染色體的4q11．q22區(qū)域或小鼠第十四對染色體上，編碼蛋白具有相同的框架結構，在轉運血清蛋白中發(fā)揮重要的作用，主要在肝組織中表達。但這四個家族成員在肝臟的發(fā)育過程有不同的表達形式，因而白蛋白家族是研究肝臟特異性基因表達調控的重要模型。有研究表明AFP及AFM參與肝癌的發(fā)生。目前眾多國內外學者已經(jīng)詳細研究了如何在轉錄水平調控Alb、AFP與DBP基因的表達，而關于如何調控AFM基因的表達，研究尚少。 該課題在前期研究的基礎上，率先分析了AFM基因啟動子活性調控區(qū)域，為揭示α白蛋白在肝臟發(fā)育過程的調控機制及肝癌發(fā)生機制提供新的思路。 目的： 1．分析AFM基因啟動子活性區(qū)域 2．尋找并研究調控AFM基因轉錄的調控因子 方法： 1．AFM基因啟動子報告質粒的構建與活性分析 分別用雙酶切和PCR方法從載體mAFM-LacZ上獲得全長與系列缺失或突變的小鼠AFM基因啟動子序列，分別克隆到pGL3-basic多克隆位點，構建含有AFM啟動子的報告質粒。重組子經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定。將重組子分別轉染不同的細胞系Hep3B，HepG2及HEK293細胞，通過檢測雙熒光素酶表達強度，評估不同的報告質粒中AFM啟動子活性。 2．轉錄因子HNFl對AFM啟動子的調控作用 將不同劑量的HNFl真核表達質粒pcDNA3-HNFlQ或pcDNA3-HNFlB單獨與AFM啟動子報告質粒pGL3-mAFM共轉染HEK293細胞，同時轉染pRL-CMV作為內參照，檢測雙熒光素酶表達強度，結果進行統(tǒng)計學分析，以均值±標準差表示。 3．轉錄因子HNF1對突變型AFM啟動子的調控作用 將0．1μg的HNF1真核表達質粒peDNA3-HNF1α或pcDNA3-HNF1β單獨與不同突變型AFM啟動子報告質粒共轉染HEK293細胞，檢測雙熒光素酶表達強度，結果進行統(tǒng)計學分析。 4．轉錄因子HNF1α與HNF1β聯(lián)合對AFM啟動子的調控作用 將不同劑量的HNF1β表達載體pcDNA3-HNF1β與0．1μg的HNF1α表達載體pcDNA3-HNFl 0【聯(lián)合與AFM啟動子報告質粒pGL3-mAFM共轉染HEK293細胞，檢測雙熒光素酶表達強度，結果進行統(tǒng)計學分析。 5．EMSA分析轉錄因子HNFI與AFM啟動子相互作用研究 針對TESS軟件分析得到的AFM啟動子上兩個HNFl結合位點site1及site2(-145及-75處)，設計合成分別攜帶野生型和突變型HNF1反應元件的探針，利用Hep3B與轉染有pcDNA3-HNF1α或peDNA3-HNF1β質粒的HEK293細胞核提取物，EMSA分析轉錄因子HNFl與AFM啟動子序列結合情況。 6．轉錄因子C／EBP對AFM啟動子的調控作用 將C／EBP真核表達質粒pcDNA3-CEBPa或／和pcDNA3-CEBPp單獨或聯(lián)合與AFM啟動子報告質粒pGL3-mAFM共轉染Hep3B細胞，檢測雙熒光素酶表達強度。 結果： 1．成功構建AFM基因啟動子報告質粒 經(jīng)測序證明成功構建了小鼠系列缺失與突變AFM啟動子的報告基因質粒。共轉染及雙熒光素酶檢測系統(tǒng)顯示，pGL3-mAFM在Hep3B與HepG2中熒光表達量分別為54．91±3．60與6．70±o．08，而在人胚腎細胞系HEK293中所構建重組子熒光素表達極低2．43±0．17，說明所構建的載體pGL3-mAFM具有特異性的AFM啟動子活性。缺失型報告載體pGL3-248與pGL3．158的熒光素酶隨著缺失序列的增加，表達強度略有減少，但當缺失了從-158～-138之間的序列，pGL3-138熒光素酶相對表達強度明顯下降，下降約90％左右；突變載體pGL3-HNF l mtl熒光素酶表達強度同樣下降90％左右。突變載體pGL3-HNF1mt2熒光素酶表達強度下降50％左右，當聯(lián)合突變HNF1兩個結合序列時，pGL3-HNF1mt12熒光素酶強度基本消失，說明轉錄起始點上游336bp序列是AFM啟動子核心序列，HNF-1結合位點是維持AFM啟動子活性重要元件。 2．轉錄因子NNF1對AFM啟動子的激活作用 HNF1表達載體pcDNA3-HNF1α或pcDNA3-HNF1β單獨與PGL3-mAFM報告載體共轉染，隨著HNF1α或HNF1β劑量的增加，AFM啟動子作用下的熒光素酶表達強度逐漸增加，但HNF1β的激活作用僅為HNF1α作用的10％左右。 3．轉錄因子HNF1對突變型AFM啟動子的激活作用 HNF1表達載體pcDNA3-HNF1α或pcDNA3-HNF1β單獨作用于突變型AFM表達載體時，結果顯示，當單獨突變sitel或site2結合位點時，HNFla作用下的轉錄活性相比野生型AFM啟動子組分別下降50％與40％左右；當單獨突變sffel結合位點時，HNF1β作用下的突變型啟動子轉錄活性較野生型AFM轉錄活性未見改變，而突變site2結合位點時，HNF1β作用下的轉錄活性較野生型AFM下降50％。說明HNF1α轉錄因子可通過Site1及site2發(fā)揮激活啟動子作用，而HNF1β主要通過site2發(fā)揮激活AFM啟動子作用。當同時突變sitel及site2位點時，HNF1α或HNF1β作用下的轉錄活性明顯下降，與pGL3-basic相比，HNF1α或HNF1β對雙突變pGL3-HNF1mt12仍有弱的激活作用，提示在AFM啟動子區(qū)域存在其他弱的HNF1結合位點。 4．轉錄因子HNF1β抑制HNF1α激活AFM啟動子作用 轉錄因子HNF1α與HNF1β表達載體與AFM啟動子共轉染，結果顯示隨著HNF1β劑量的增加，HNF1α作用下的AFM轉錄活性逐漸下降。 5．AFM基因啟動子區(qū)HNF1反應元件與蛋白相互作用分析 EMSA結果顯示，AFM啟動子上兩個HNF1結合位點(site1與site2)都可與核提取物中HNF1α與HNF1β蛋白形成復合物結合條帶。自身非標記序列競爭探針使目的條帶完全消失，以突變的Site1與Site2非標記序列競爭探針，蛋白DNA結合復合物條帶不變。為了分析site1與site2與HNF1蛋白結合能力的強弱，以非標記的不同劑量的β-fibrinogen，site1與site2序列競爭β-fibrinogen標記探針，EMSA實驗結果顯示，上述各序列與HNF1結合能力強弱為：β-fibrinogensite1site2。 6．轉錄因子C/EBP不能調控AFM啟動子活性 轉錄因子C／EBP表達載體與攜帶有AFM啟動子的報告質粒pGL3-mAFM共轉染Hep3B細胞系。雙熒光素酶報告基因分析顯示，peDNA3-C／EBPα或pcDNA3-C／EBPβ單獨或聯(lián)合轉染，未改變AFM啟動子作用下的熒光素酶強度。 結論： 1．軟件分析及缺失報告基因分析，發(fā)現(xiàn)AFM基因啟動子位于轉錄起始點上游-336bp～0處。 2．AFM啟動子-145處及-75處的HNF1結合位點是AFM啟動子的重要組成元件，且site1較site2在AFM啟動子轉錄活性中發(fā)揮更重要的作用。 3．EMSA結果提示轉錄因子HNF1α與HNF1β可直接結合在AFM啟動子上兩個HNF1結合位點處，雙熒光檢測系統(tǒng)提示轉錄因子HNF1α與HNF1β發(fā)揮反式激活作用。 4．轉錄因子HNF1α與HNF1β在維持AFM啟動子活性中發(fā)揮重要作用，且HNF1β可以抑制HNF1α激活AFM啟動子作用。 5．轉錄因子C／EBP不能激活AFM啟動子轉錄活性。 本研究深入探討了AFM基因的表達調控機制，為闡明肝特異性基因調節(jié)機制奠定了基礎，為探索肝臟發(fā)育及肝癌發(fā)生提供了新的理論依據(jù)。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

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山東大學博士學位論文 2345678910圖2一 7pGL3B一dell97與pGL3B一dell97C卿emt鑒定圖FigZ一 7IdeniifieationofrePorterPlasmidPGL3B一 del197andPGL3B一 dell97Cmyemt 1.PGL3B一 dell97Plamid 2.PGL3B一 del197digestedwithMlul 3.PGL3B一 dell97digestedwithHindlll 4.PGL3B一 del197identifieation誠 thPCR 5.2000markCr 6.15000marker 7.PGL3B一 dell97CmyemtPlasmid 8.PGL3B一 dell97CmyemtdigestedwithMlul 9.PGL3B一 dell97CmyemtdigestedwithHindlll10.PGL3B一 dell97CmyemtideniifieationwithPCR圖2一8報告質粒pGL3B一 del197Cmyemtl和pGL3B一 dell97CmyemtZ鑒定圖FigZ一 8IdeniificationofrePortPlasmidPGL3B一 dell97CmyemtlandPGL3B一 dell97CmyemtZ 1.PGL3B一 dell97Cmyemtldigestedwith KPn1andHindlll 2.PGL3B一 dell97CmyemtZdigestedwith KPn1andHindlll M20O0marker圖2一9報告質粒pGL3B一dell32，PGL3B一 dell32mtl，PGL3B一 dell32mtZ鑒定圖FigZ一 9IdentifieationofreeomblnantorofPGL3B一dell32，PGL3B一 dell32mtl，PGL3B一 del132mtZ M2000marker 1.PGL3B一 dell32identifieation初 thPCR 2.PGL3B一 dell32mtlidentifieationwithPCR 3.PGL3B一 dell32mtZideniifieation誠

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【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 魏春山;葉下珠及其復方對HBx介導肝癌VEGFR3表達的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學;2012年

本文編號：2827149