一、研究背景和目的 β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt信號通路中至關(guān)重要的成員之一,對細(xì)胞的生長、再生、分化等起重要的調(diào)節(jié)作用。胞漿中的β-catenin分子在受到Wnt配體的刺激后與轉(zhuǎn)錄因子Tcf4/Lef結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)入核,啟動下游靶基因如c-Myc、CyclinD1、Survivin等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和凋亡。同時,β-catenin又與跨膜黏附分子鈣黏附素(cadherin)相連,參與細(xì)胞黏附。肝臟的眾多生理和病理過程與Wnt/β-catenin信號通路,尤其是β-catenin基因的異常改變密切相關(guān)。β-catenin對于肝臟發(fā)育、肝細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用,肝細(xì)胞癌和肝胚細(xì)胞瘤也與β-catenin的異常改變有關(guān)。然而,Wnt/β-catenin信號通路,尤其是β-catenin在急性肝損傷中的主要作用尚未明確。 急性肝損傷是一種非常嚴(yán)重的臨床綜合征,死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量飲酒和應(yīng)用肝毒性藥物是其誘因。大量肝細(xì)胞壞死和凋亡是急性肝損傷過程中十分重要的病理學(xué)特征。Fas是介導(dǎo)凋亡信號通路的細(xì)胞表面抗原,當(dāng)與特異的配體或抗體結(jié)合后可以啟動半胱天冬酶級聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。小鼠給予抗Fas抗體(Jo2)后可通過誘導(dǎo)大量的細(xì)胞凋亡而引起死亡。細(xì)菌脂多糖(LPS)是一種強(qiáng)誘導(dǎo)物,可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO),誘導(dǎo)由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的急性肝損傷。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增強(qiáng)嚙齒類動物肝臟對LPS刺激的敏感性,LPS聯(lián)合D-GalN可誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。 本實驗將運(yùn)用肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin的基因敲除小鼠分別建立抗-Fas抗體和LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠實驗性急性肝損傷模型,分別研究β-catenin在兩種急性肝損傷模型中的作用。 二、材料和方法 1.從美國Jackson實驗室引進(jìn)B6.129-Ctnnb1tm2Kem/KnwJ(在β-catenin基因的內(nèi)含子1和6中有Lox P位點)和B6.Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增強(qiáng)子/啟動子支配的Cre)小鼠,通過兩種小鼠的2次雜交,繁育出肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin(β-catenin KO)的小鼠并從基因表型(PCR)和肝細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)水平以及免疫組化(抗β-catenin抗體)三方面進(jìn)行鑒定。2.選擇雄性6-8周齡,體重約18-23g Alb-cre;β-cateninloxP/loxP小鼠,隨機(jī)分為Jo2處理組(n=6)、LPS/D-GalN處理組(n=6)和未處理組(n=4)。同窩Alb-cre;β-cateninloxP/+,β-cateninloxP/+,β-cateninloxP/loxP共同做為對照組(Control),隨機(jī)分為Jo2處理組(n=7)、LPS/D-GalN處理組(n=6)和未處理組(n=4)。Jo2處理組腹腔注射Jo2(0.5ug/g體重),LPS處理組腹腔注射LPS(80ug/g體重)+D-GalN(800ug/g體重)。處理組于注射后6h脫頸處死,同時處死未處理組。3.留取血清和肝組織標(biāo)本,(1)通過檢測血清轉(zhuǎn)氨酶水平,HE染色研究肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷程度的影響。(2)通過Real-time PCR檢測炎性因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的水平,研究肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷炎癥反應(yīng)的影響。(3)、應(yīng)用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法檢測肝細(xì)胞凋亡情況,用Western blot方法檢測肝細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子(Caspase-3、PARP、Bcl-2)的水平,通過免疫組化的方法檢測P65表達(dá),研究肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷中肝細(xì)胞凋亡情況以及凋亡相關(guān)信號分子的改變情況。(4)檢測LPS/ D-GalN刺激后肝組織iNOS和GSH的表達(dá)水平,研究肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin對氧化應(yīng)激的影響.4.應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。 三、結(jié)果 1.繁育出肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠。對轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表型鑒定,肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠的基因表型為:ctnnb純合(-/-)并且Alb-Cre陽性表達(dá)。免疫組化方面,野生型小鼠肝組織中內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞表達(dá)β-catenin;肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠的肝臟僅在內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上有β-catenin染色,肝細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)β-Catenin染色。應(yīng)用抗-β-catenin抗體進(jìn)行Western Blot分析證明肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin基因的小鼠肝臟β-catenin基因表達(dá)水平明顯低于野生型。 2.在Jo2誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中,β-catenin KO組小鼠血清ALT、AST水平明顯高于對照組,P0.05;實時定量PCR結(jié)果顯示IL-6、IFN-γ水平略高于Control組; HE染色結(jié)果(200X)見β-catenin KO組竇狀隙明顯膨脹、充血,肝細(xì)胞大片嗜酸性壞死,局灶出血,小葉結(jié)構(gòu)紊亂,少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤;Control組見竇狀隙輕微腫脹、充血,少量肝細(xì)胞呈嗜酸性變和壞死,小葉結(jié)構(gòu)尚完整,局灶出血,散在淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤。免疫組化結(jié)果β-catenin KO組核陽性的p65染色少于Control組。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡可見每高倍視野β-catenin KO組凋亡細(xì)胞個數(shù)明顯高于Control組(P0.05)。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin KO組活化的Caspase-3、PARP表達(dá)高于Control組,Bcl-2水平低于對照組。 3.在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中,β-catenin KO組血清ALT、AST水平明顯低于對照組(P0.05);實時定量PCR結(jié)果顯示β-catenin KO組IL-6、iNOS水平略低于Control組,Bcl-xL水平高于對照組; HE染色結(jié)果(200X)見β-catenin KO組竇狀隙散在膨脹、充血,炎細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞片狀嗜酸性壞死,局灶出血;Control組見竇狀隙嚴(yán)重腫脹、充血,大片狀肝細(xì)胞壞死,炎細(xì)胞浸潤,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂。免疫組化結(jié)果β-catenin KO核陽性的p65染色同Control組相比無明顯差別。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡可見每高倍視野β-catenin KO組凋亡細(xì)胞個數(shù)明顯低于Control組(P0.05)。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin KO組Caspase-3、PARP表達(dá)低于Control組,Bcl-2表達(dá)高于對照組。肝組織GSH檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin KO組GSH水平高于Control組。 四、結(jié)論 1.肝細(xì)胞特異性β-catenin基因敲除小鼠在Jo2誘導(dǎo)的急性肝損傷過程中肝損傷程度明顯高于對照組,提示β-catenin基因?qū)as介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用,其機(jī)制可能與β-catenin基因的抗凋亡作用有關(guān)。 2.肝細(xì)胞特異性β-catenin基因敲除小鼠在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷過程中肝損傷程度明顯低于對照組,提示β-catenin基因可加重由LPS/D-GalN引起的肝損傷,其機(jī)制可能是β-catenin參與了LPS/D-GalN誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致急性肝損傷。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

為：ctnnb 純合（loxP/loxP）并且 Alb-Cre 陽性表達(dá)（圖1.A）。應(yīng)用 Western blot 方法分別檢測野生型和肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 小鼠的肝組織蛋白，證實野生型小鼠肝組織β-catenin 蛋白表達(dá)豐度明顯高于肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 小鼠（圖 1.B）。應(yīng)用抗β-catenin 抗體對野生型和肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 小鼠的肝組織分別行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠的肝組織中，內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞均表達(dá)β-catenin；而肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 小鼠的肝組織中，僅在內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上有β-catenin 染色，肝細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)β-catenin 染色，進(jìn)一步證實實現(xiàn)了肝細(xì)胞特異性敲除了β-catenin（圖 1.C）。圖 1.肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠的鑒定。A.基因表型鑒定：肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠的基因表形如圖A第 1.2 泳道所示，Alb-cre陽性表達(dá)，ctnnbloxP/loxP.；B.western blot檢

第二軍醫(yī)大學(xué) 2006 級碩士學(xué)位論文非實質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)β-catenin，而肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin的小鼠肝細(xì)胞中不表達(dá)-catenin，僅在細(xì)胞膜上有少量β-catenin表達(dá)。二、肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 導(dǎo)致肝臟體積減小。有研究表明β-catenin 對肝臟發(fā)育、肝細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用經(jīng)過稱量小鼠體重、肝重，我們發(fā)現(xiàn)野生型小鼠和肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 鼠的體重?zé)o明顯差別，而肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 小鼠的肝重以及肝重/體重值明顯低于對照組（圖 2），說明肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 導(dǎo)致肝臟體積減小。

圖 3 肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin 導(dǎo)致 Fas 誘導(dǎo)的肝損傷加重。A.小鼠血清 ALT 水平,處理組血清 ALT 水平顯著高于未處理組,其中處理組β-catenin KO 組 ALT 水平顯著高于 Control ;B.小鼠血清 AST 水平,處理組血清 AST 水平顯著高于未處理組,處理后β-catenin KO 組血清 AST 水平顯著高于 Control 組。數(shù)據(jù)用 Mean±SEM 表示。*P<0.05。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2825762