發(fā)布時間：2020-09-24 13:08

　　 一、研究背景和目的 β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt信號通路中至關重要的成員之一,對細胞的生長、再生、分化等起重要的調(diào)節(jié)作用。胞漿中的β-catenin分子在受到Wnt配體的刺激后與轉(zhuǎn)錄因子Tcf4/Lef結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復合物轉(zhuǎn)運入核,啟動下游靶基因如c-Myc、CyclinD1、Survivin等的轉(zhuǎn)錄和表達,調(diào)節(jié)細胞的生長和凋亡。同時,β-catenin又與跨膜黏附分子鈣黏附素(cadherin)相連,參與細胞黏附。肝臟的眾多生理和病理過程與Wnt/β-catenin信號通路,尤其是β-catenin基因的異常改變密切相關。β-catenin對于肝臟發(fā)育、肝細胞的增殖和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用,肝細胞癌和肝胚細胞瘤也與β-catenin的異常改變有關。然而,Wnt/β-catenin信號通路,尤其是β-catenin在急性肝損傷中的主要作用尚未明確。 急性肝損傷是一種非常嚴重的臨床綜合征,死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量飲酒和應用肝毒性藥物是其誘因。大量肝細胞壞死和凋亡是急性肝損傷過程中十分重要的病理學特征。Fas是介導凋亡信號通路的細胞表面抗原,當與特異的配體或抗體結(jié)合后可以啟動半胱天冬酶級聯(lián),導致細胞凋亡。小鼠給予抗Fas抗體(Jo2)后可通過誘導大量的細胞凋亡而引起死亡。細菌脂多糖(LPS)是一種強誘導物,可促進巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO),誘導由氧化應激介導的急性肝損傷。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增強嚙齒類動物肝臟對LPS刺激的敏感性,LPS聯(lián)合D-GalN可誘導小鼠急性肝損傷。 本實驗將運用肝細胞特異性敲除β-catenin的基因敲除小鼠分別建立抗-Fas抗體和LPS/D-GalN誘導的小鼠實驗性急性肝損傷模型,分別研究β-catenin在兩種急性肝損傷模型中的作用。 二、材料和方法 1.從美國Jackson實驗室引進B6.129-Ctnnb1tm2Kem/KnwJ(在β-catenin基因的內(nèi)含子1和6中有Lox P位點)和B6.Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增強子/啟動子支配的Cre)小鼠,通過兩種小鼠的2次雜交,繁育出肝細胞特異性敲除β-catenin(β-catenin KO)的小鼠并從基因表型(PCR)和肝細胞β-catenin蛋白表達水平以及免疫組化(抗β-catenin抗體)三方面進行鑒定。2.選擇雄性6-8周齡,體重約18-23g Alb-cre;β-cateninloxP/loxP小鼠,隨機分為Jo2處理組(n=6)、LPS/D-GalN處理組(n=6)和未處理組(n=4)。同窩Alb-cre;β-cateninloxP/+,β-cateninloxP/+,β-cateninloxP/loxP共同做為對照組(Control),隨機分為Jo2處理組(n=7)、LPS/D-GalN處理組(n=6)和未處理組(n=4)。Jo2處理組腹腔注射Jo2(0.5ug/g體重),LPS處理組腹腔注射LPS(80ug/g體重)+D-GalN(800ug/g體重)。處理組于注射后6h脫頸處死,同時處死未處理組。3.留取血清和肝組織標本,(1)通過檢測血清轉(zhuǎn)氨酶水平,HE染色研究肝細胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導的肝損傷程度的影響。(2)通過Real-time PCR檢測炎性因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的水平,研究肝細胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導的肝損傷炎癥反應的影響。(3)、應用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法檢測肝細胞凋亡情況,用Western blot方法檢測肝細胞凋亡相關信號通路關鍵分子(Caspase-3、PARP、Bcl-2)的水平,通過免疫組化的方法檢測P65表達,研究肝細胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導的肝損傷中肝細胞凋亡情況以及凋亡相關信號分子的改變情況。(4)檢測LPS/ D-GalN刺激后肝組織iNOS和GSH的表達水平,研究肝細胞特異性敲除β-catenin對氧化應激的影響.4.應用SPSS統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。 三、結(jié)果 1.繁育出肝細胞特異性敲除β-catenin小鼠。對轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表型鑒定,肝細胞特異性敲除β-catenin小鼠的基因表型為:ctnnb純合(-/-)并且Alb-Cre陽性表達。免疫組化方面,野生型小鼠肝組織中內(nèi)皮細胞和肝細胞表達β-catenin;肝細胞特異性敲除β-catenin小鼠的肝臟僅在內(nèi)皮細胞的細胞膜上有β-catenin染色,肝細胞未發(fā)現(xiàn)β-Catenin染色。應用抗-β-catenin抗體進行Western Blot分析證明肝細胞特異性敲除β-catenin基因的小鼠肝臟β-catenin基因表達水平明顯低于野生型。 2.在Jo2誘導的急性肝損傷模型中,β-catenin KO組小鼠血清ALT、AST水平明顯高于對照組,P0.05;實時定量PCR結(jié)果顯示IL-6、IFN-γ水平略高于Control組; HE染色結(jié)果(200X)見β-catenin KO組竇狀隙明顯膨脹、充血,肝細胞大片嗜酸性壞死,局灶出血,小葉結(jié)構(gòu)紊亂,少量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤;Control組見竇狀隙輕微腫脹、充血,少量肝細胞呈嗜酸性變和壞死,小葉結(jié)構(gòu)尚完整,局灶出血,散在淋巴細胞和中性粒細胞浸潤。免疫組化結(jié)果β-catenin KO組核陽性的p65染色少于Control組。TUNEL法檢測細胞凋亡可見每高倍視野β-catenin KO組凋亡細胞個數(shù)明顯高于Control組(P0.05)。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin KO組活化的Caspase-3、PARP表達高于Control組,Bcl-2水平低于對照組。 3.在LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷模型中,β-catenin KO組血清ALT、AST水平明顯低于對照組(P0.05);實時定量PCR結(jié)果顯示β-catenin KO組IL-6、iNOS水平略低于Control組,Bcl-xL水平高于對照組; HE染色結(jié)果(200X)見β-catenin KO組竇狀隙散在膨脹、充血,炎細胞浸潤,肝細胞片狀嗜酸性壞死,局灶出血;Control組見竇狀隙嚴重腫脹、充血,大片狀肝細胞壞死,炎細胞浸潤,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂。免疫組化結(jié)果β-catenin KO核陽性的p65染色同Control組相比無明顯差別。TUNEL法檢測細胞凋亡可見每高倍視野β-catenin KO組凋亡細胞個數(shù)明顯低于Control組(P0.05)。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin KO組Caspase-3、PARP表達低于Control組,Bcl-2表達高于對照組。肝組織GSH檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin KO組GSH水平高于Control組。 四、結(jié)論 1.肝細胞特異性β-catenin基因敲除小鼠在Jo2誘導的急性肝損傷過程中肝損傷程度明顯高于對照組,提示β-catenin基因?qū)as介導的肝細胞凋亡起保護作用,其機制可能與β-catenin基因的抗凋亡作用有關。 2.肝細胞特異性β-catenin基因敲除小鼠在LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷過程中肝損傷程度明顯低于對照組,提示β-catenin基因可加重由LPS/D-GalN引起的肝損傷,其機制可能是β-catenin參與了LPS/D-GalN誘導的氧化應激導致急性肝損傷。
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

為：ctnnb 純合（loxP/loxP）并且 Alb-Cre 陽性表達（圖1.A）。應用 Western blot 方法分別檢測野生型和肝細胞特異性敲除β-catenin 小鼠的肝組織蛋白，證實野生型小鼠肝組織β-catenin 蛋白表達豐度明顯高于肝細胞特異性敲除β-catenin 小鼠（圖 1.B）。應用抗β-catenin 抗體對野生型和肝細胞特異性敲除β-catenin 小鼠的肝組織分別行免疫組織化學染色，發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠的肝組織中，內(nèi)皮細胞和肝細胞均表達β-catenin；而肝細胞特異性敲除β-catenin 小鼠的肝組織中，僅在內(nèi)皮細胞的細胞膜上有β-catenin 染色，肝細胞未發(fā)現(xiàn)β-catenin 染色，進一步證實實現(xiàn)了肝細胞特異性敲除了β-catenin（圖 1.C）。圖 1.肝細胞特異性敲除β-catenin小鼠的鑒定。A.基因表型鑒定：肝細胞特異性敲除β-catenin小鼠的基因表形如圖A第 1.2 泳道所示，Alb-cre陽性表達，ctnnbloxP/loxP.；B.western blot檢

第二軍醫(yī)大學 2006 級碩士學位論文非實質(zhì)細胞都表達β-catenin，而肝細胞特異性敲除β-catenin的小鼠肝細胞中不表達-catenin，僅在細胞膜上有少量β-catenin表達。二、肝細胞特異性敲除β-catenin 導致肝臟體積減小。有研究表明β-catenin 對肝臟發(fā)育、肝細胞的增殖和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用經(jīng)過稱量小鼠體重、肝重，我們發(fā)現(xiàn)野生型小鼠和肝細胞特異性敲除β-catenin 鼠的體重無明顯差別，而肝細胞特異性敲除β-catenin 小鼠的肝重以及肝重/體重值明顯低于對照組（圖 2），說明肝細胞特異性敲除β-catenin 導致肝臟體積減小。

圖 3 肝細胞特異性敲除β-catenin 導致 Fas 誘導的肝損傷加重。A.小鼠血清 ALT 水平,處理組血清 ALT 水平顯著高于未處理組,其中處理組β-catenin KO 組 ALT 水平顯著高于 Control ;B.小鼠血清 AST 水平,處理組血清 AST 水平顯著高于未處理組,處理后β-catenin KO 組血清 AST 水平顯著高于 Control 組。數(shù)據(jù)用 Mean±SEM 表示。*P<0.05。

【共引文獻】

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本文編號：2825762