肝炎病毒、藥物、酒精等因素引起的肝功能衰竭(簡稱肝衰竭)是臨床治療中的一大頑疾。迄今,肝臟移植是唯一證實有效的治療手段,但其受到肝臟來源缺乏、手術(shù)費用昂貴等因素的限制。生物人工肝、肝細胞移植、肝組織工程的研究為終末期肝病的治療帶來新的希望,但缺乏有效的肝細胞來源是這三者臨床應(yīng)用的最大瓶頸。胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs),由于具有多向分化、自我更新、無限增殖的特性,有望成為新的肝細胞來源。然而,目前仍缺乏有效的ESCs向肝細胞定向誘導(dǎo)分化策略。 近年來,隨著對細胞可塑性的重新認識,越來越多的證據(jù)證實轉(zhuǎn)錄因子在細胞的命運歸屬與轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著決定性的作用,少量關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子可以直接促進各類細胞發(fā)生分化、去分化以及轉(zhuǎn)分化。我們推測,是否存在特定的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子組合可以促進ESCs向肝細胞定向分化。已知叉頭框A2(forkhead box A2,Foxa2)與肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha , Hnf4a)是分別在肝臟發(fā)育早期和中期開始表達的兩個肝臟核心轉(zhuǎn)錄因子,在促進肝臟發(fā)育與維持肝細胞功能中發(fā)揮著核心的作用。共組成性表達Foxa2和Hnf4a對ESCs向肝細胞的定向分化有何影響尚無相關(guān)研究報道。為此,本研究探索了組成性表達Foxa2和Hnf4a對ESCs向肝細胞定向分化中的影響,試圖為從ESCs獲取肝細胞提供一種新模式。 快捷而高效的ESCs基因修飾是本文研究的前提,而ESCs是難以進行基因修飾的細胞之一。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、腺病毒等瞬時基因修飾方法不適用于ESCs。第三代慢病毒表達載體具有可穩(wěn)定介導(dǎo)外源基因整合入目的細胞基因組、可感染靜止期細胞和相對安全等特點,是進行ESCs基因修飾的較好選擇。但第三代慢病毒表達載體包裝制備難度大,ESCs對其進入細胞內(nèi)具有一定程度的抵抗,在ESCs中目的基因容易發(fā)生基因沉默。另外,ESCs的維持培養(yǎng)需要在含白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)的特殊培養(yǎng)基中,并且一般需要小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)作為飼養(yǎng)層細胞。在進行基因修飾時,陽性克隆的篩選和ESCs特性的維持是一大難題。因此,有必要探索優(yōu)化第三代慢病毒表達載體的構(gòu)建、包裝制備以及慢病毒介導(dǎo)的ESCs基因修飾等方法。 為此,本研究擬首先構(gòu)建適于熒光示蹤標記、利于ESCs基因修飾和穩(wěn)定表達的系列第三代慢病毒表達載體。其次,基于磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)與攜帶綠色熒光的慢病毒表達載體2K7bsd-EFp-EGFP,探索大量、高效包裝制備慢病毒的方法,并利用該方法包裝制備攜帶Foxa2和Hnf4a的慢病毒顆粒。然后,利用制備的2K7bsd-EFp-EGFP慢病毒顆粒和小鼠胚胎干細胞株CCE,建立ESCs快速基因修飾的方法,并采用該方法制備組成性表達Foxa2和Hnf4a的ESCs。最后,基于攜帶有外源基因的ESCs和不同的誘導(dǎo)環(huán)境,評價Foxa2和Hnf4a單獨和共同組成性表達(Constitutive Expression)對ESCs向肝細胞誘導(dǎo)分化的影響。 本研究的主要研究方法和結(jié)果如下: 1.利用第三代慢病毒表達載體2K7bsd和2K7neo、人延長因子1A啟動子(human elongation factor 1 alpha promoter, EFp)、小鼠白蛋白增強子啟動子(mouse albumin enhancer promoter, ALBep)、土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional response element,WRPE)、編碼人源Foxa2和Hnf4a全長開放閱讀框(open reading frame,ORF)的cDNA等元件,成功的構(gòu)建了適于熒光示蹤標記和利于ESCs基因修飾和穩(wěn)定表達的系列慢病毒表達載體2K7bsd-EFp-EGFP, 2K7neo-EFp-Foxa2, 2K7bsd-EFp-Hnf4a, 2K7bsd-ALBep-EGFP。 2.基于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法,利用293FT細胞、包裝質(zhì)粒(pLP1、pLP2、pLP/VSVG)和慢病毒表達載體2K7bsd-EFp-EGFP,從質(zhì)粒的濃度和質(zhì)量、表達載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒四種質(zhì)粒的比例,轉(zhuǎn)染液的pH值、293FT細胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染的時機、慢病毒的收獲濃縮以及滴度測定等方面進行了優(yōu)化,探索出了一套慢病毒表達載體的高效包裝和大量制備的方法。并利用優(yōu)化的制備慢病毒顆粒的方法,大量包裝制備了慢病毒顆粒2K7bsd-EFp-EGFP, 2K7neo-EFp-Foxa2, 2K7bsd-EFp-Hnf4a。 3.建立了大量制備、處理和凍存小鼠胚胎成纖維細胞的方法,并且該方法廉價、方便,適合小鼠ESCs的維持培養(yǎng)。 4.利用前期制備的2K7bsd-EFp-EGFP慢病毒顆粒,從慢病毒的感染時機和方式、ESCs培養(yǎng)基、感染后藥物篩選時間、飼養(yǎng)層細胞的添加、克隆挑選等方面優(yōu)化了慢病毒介導(dǎo)的小鼠ESCs基因修飾方法。探索出了一套高效快速的慢病毒介導(dǎo)的小鼠ESCs基因修飾的方法。利用前期制備的慢病毒顆粒和以上摸索好條件的小鼠ESCs基因修飾方法,進行了ESCs的基因修飾,成功構(gòu)建了CCE-EGFP、CCE-Foxa2, CCE-Hnf4a, CCE-Foxa2/Hnf4a的細胞株。并通過了PCR酶切鑒定和蛋白免疫印跡(Western Blot)、免疫熒光檢測鑒定。 5.進行了CCE,CCE-Foxa2, CCE-Hnf4a, CCE-Foxa2/Hnf4a維持培養(yǎng)和畸胎瘤形成實驗,結(jié)果提示經(jīng)過基因修飾的ESCs,仍然能維持ESCs正常增殖和形態(tài)特征。將四種細胞移植到裸鼠體內(nèi)均能畸胎瘤,并在其中均可發(fā)現(xiàn)內(nèi)中外三個胚層的細胞組織,四者之間無明顯差異。 6.將CCE、CCE-Foxa2、CCE-Hnf4a、CCE-Foxa2/Hnf4a四種細胞在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)境中,通過形態(tài)觀察、實時熒光定量PCR檢測、免疫熒光檢測等監(jiān)測指標,探索了Foxa2和Hnf4a組成性表達對ESCs向肝細胞分化的影響。結(jié)果提示在自發(fā)分化、無任何外界誘導(dǎo)劑的情況下,四種細胞在向肝細胞分化方面無明顯差異。而在含有DMSO等誘導(dǎo)劑的協(xié)助下,Foxa2可明顯的促進ESCs向肝細胞分化。同樣的條件下,Hnf4a并無明顯的促進ESCs向肝細胞分化的作用,而在Foxa2和Hnf4a共同的作用下,有一定的促進ESCs向肝細胞分化作用,但效果并不如單獨Foxa2作用明顯。 總之,本研究在前期首先構(gòu)建了課題所需的系列第三代慢病毒表達載體,基于磷酸轉(zhuǎn)染方法,探索了一套高效而大量的慢病毒表達載體包裝制備方法,制備了相關(guān)的慢病毒顆粒;而后進行了慢病毒介導(dǎo)的ESCs快速基因修飾研究,制備了可穩(wěn)定表達目的基因的ESCs株;并利用這些細胞進行了組成性表達Foxa2和Hnf4a對ESCs向肝細胞分化影響的初步研究。本研究為進行ESCs基因修飾相關(guān)研究提供了穩(wěn)定可靠的方法和工具,也為進一步研究其它轉(zhuǎn)錄因子在ESCs定向分化中的作用提供了新的思路與實驗依據(jù)。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R575.3
【部分圖文】：

后續(xù)步驟與上類同。ALBep-EGFP，2K7bsd-EFp-EGFP，2K7neo-EFp-Foxa2 和 2K7bsd-EFp-Hnf4aluⅠ酶切位點的 WPRE 引物從 2K7bsd中擴增 WPRE 片段，以 Mlu，同時以 MluⅠ酶切 2K7bsd-ALBep-EGFP-0，2K7bsd-EFp-EGFP-0，0 和 2K7bsd-EFp-Hnf4a-0。分別將 WPRE 片段與四個質(zhì)粒連接。后續(xù)這里由于 WPRE 兩側(cè)為單一酶切位點，WPRE 的插入可能會導(dǎo)致正結(jié)果，而只有在順向插入時，WPRE 元件才可以起到增強目的基因采用 pEGFP-WRPE-UP、EF-Gene-Wpre-up 和 EF-Gene-Wpre-down插入情況和 WPRE 的插入方向。eo載體內(nèi)含有 WPRE，但按照作者構(gòu)建方案49和我們的驗證結(jié)果， R4-R2 盒內(nèi)，并不位于 R4-R2 盒的末端，參考 WPRE 發(fā)揮作用的原位并不能發(fā)揮增強轉(zhuǎn)錄和表達效果，且在本實驗設(shè)計方案中設(shè)計的除，故需要重新擴增并將其插入在目的基因終止密碼子后一段區(qū)域。四個第三代慢病毒表達載體的示意圖見圖 1-1。

圖 C圖 1-2：初始質(zhì)粒鑒定圖。：圖 A，pALB/EGFP 質(zhì)粒酶切鑒定圖；圖 B，2K7neo(左)和 2K7bsd(右)酶切鑒定圖圖 C，包裝質(zhì)粒鑒定圖。定構(gòu)建的序列慢病毒表達載體意圖(見圖 1-1)最終構(gòu)建了 2K7bsd-ALBep-EGFP ， 2K7bsd--Foxa2 和 2K7bsd-EFp-Hnf4a 4 個第三代慢病毒表達載體。通過或特殊的酶切位點進行鑒定(見圖 1-3)。所有的質(zhì)粒將用 BamHCⅠ兩組限制性內(nèi)切酶組合進行雙酶切鑒定。BamHⅠ+MluⅠ目的基因片段和 WPRE 元件三個片段。KpnⅠ+PamCⅠ酶切的是 2K7bsd還是 2K7neo，其中 bsd 片段要小于 neo 片段，借此可xa2 和 Hnf4a 對應(yīng)的引物進一步 PCR 鑒定了 2K7neo-E-Hnf4a 和載體。所有的質(zhì)粒送測序，包括目的基因的全長序列的完整性和正確性，結(jié)果顯示正確。

圖 C圖 1-2：初始質(zhì)粒鑒定圖。B/EGFP 質(zhì)粒酶切鑒定圖；圖 B，2K7neo(左)和 2K7bsd(圖 C，包裝質(zhì)粒鑒定圖。序列慢病毒表達載體圖 1-1)最終構(gòu)建了 2K7bsd-ALBep-EGFP2K7bsd-EFp-Hnf4a 4 個第三代慢病毒表達酶切位點進行鑒定(見圖 1-3)。所有的質(zhì)粒制性內(nèi)切酶組合進行雙酶切鑒定。Bam片段和 WPRE 元件三個片段。KpnⅠ+Pam還是 2K7neo，其中 bsd 片段要小于 neo 片段nf4a 對應(yīng)的引物進一步 PCR 鑒定了體。所有的質(zhì)粒送測序，包括目的基因正確性，結(jié)果顯示正確。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Stefania Lorenzini;Stefano Gitto;Elena Grandini;Pietro Andreone;Mauro Bernardi;;Stem cells for end stage liver disease: How far have we got?[J];World Journal of Gastroenterology;2008年29期

本文編號：2825753