研究背景:肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥,在我國肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎,其中最主要的是乙肝病毒(hepatitis Bvirus,HBV)感染。而高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1protein,HMGB1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì),已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個重要的新靶標(biāo)。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時肝細(xì)胞HMGB1的移位及釋放情況。 目的:(1)研究LPS或TNF-α刺激是否可引起肝細(xì)胞HMGB1的移位及釋放,檢測是否同時伴有其他細(xì)胞因子的分泌;(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞HMGB1移位;(3)研究D-GalN+LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞HMGB1移位;(4)初步探討肝細(xì)胞HMGB1移位及釋放的可能機制。 方法:(1)體外用不同濃度LPS或TNF-α刺激肝細(xì)胞系HepG2細(xì)胞,不同時間點分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。MTT法測定細(xì)胞存活率,TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率,同時測定培養(yǎng)上清中的LDH含量,以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。Western blotting方法檢測培養(yǎng)上清,細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中HMGB1的含量,免疫熒光技術(shù)觀察HMGB1移位。ELISA,細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎,慢性乙型肝炎患者及正常肝組織,免疫組織化學(xué)染色觀察HMGB1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時行HE染色,評估肝組織的病理學(xué)改變。(3)D-GalN聯(lián)合LPS腹腔注射,誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型,同時設(shè)置生理鹽水對照組。于D-GalN+LPS注射后3h處死動物,收集肝臟組織,進(jìn)行HMGB1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用Western blotting和免疫熒光技術(shù),分別觀察來普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)對LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞HMGB1移位和釋放的影響。 結(jié)果:(1)體外用LPS或TNF-α刺激可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞釋放HMGB1,釋放到上清中的HMGB1量隨著作用時間延長而增高,20h時達(dá)到峰值,免疫熒光觀察到HepG2細(xì)胞胞核中的HMGB1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi),LPS(≤400ng/mL)或TNF-α(≤25ng/mL)誘導(dǎo)的HMGB1分泌量隨LPS或TNF-α劑量增加而增加。MTT,TUNEL檢測及上清中LDH含量測定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白Western blotting分析亦證實了細(xì)胞漿中的HMGB1表達(dá)增強。ELISA和細(xì)胞因子抗體芯片檢測表明LPS,TNF-α或重組HMGB1刺激HepG2細(xì)胞24h,僅見個別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的HMGB1的移位,移位率約為32.84%±7.13%。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中,肝細(xì)胞HMGB1集中分布于細(xì)胞核中,未見明顯的移位。(3)D-GalN+LPS注射后3h,發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為:27.42%±4.99%。移位率與生理鹽水對照組比較,顯著為高(P＜0.01)。(4)體外CRM1抑制劑LMB可以顯著減少LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞HMGB1的釋放,及HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA可以促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的HMGB1釋放,促進(jìn)HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論:(1)LPS或TNF-α可時間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞核蛋白HMGB1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在HMGB1從細(xì)胞核向胞漿的移位,而在慢性乙型肝炎及正常對照肝細(xì)胞中并無這種移位現(xiàn)象。(3)D-Gal+LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞HMGB1存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞HMGB1的移位和釋放可能存在CRM1依賴的核轉(zhuǎn)運,可能與乙�；嚓P(guān)。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R575.3
【部分圖文】：

81216202448時間(h)圖1一1， LPS(100ng/mL)或TNF一 a(25ng/mL)作用后不同時間點， 11epGZ細(xì)胞的存活率圖。120100n八曰曰

本文編號：2821931