胃腸動(dòng)力性疾病是一種由神經(jīng)支配調(diào)節(jié)障礙所致的胃腸動(dòng)力或感覺(jué)疾病,可能伴有內(nèi)臟感知的異常。以神經(jīng)胃腸病學(xué)為基礎(chǔ),曼谷新分類(lèi)按神經(jīng)損害部位及動(dòng)力異常特點(diǎn)進(jìn)行分類(lèi),即是原發(fā)于胃腸神經(jīng)元或肌源性動(dòng)力病和繼發(fā)于全身器質(zhì)性病的胃腸動(dòng)力病。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)是胃腸道的一種問(wèn)質(zhì)細(xì)胞。ICC主要具有起搏功能和介導(dǎo)神經(jīng)傳遞的作用,在胃腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。ICC的形態(tài)改變、數(shù)量異常和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的改變與許多胃腸道動(dòng)力疾病密切相關(guān),如慢傳輸型便秘、假性腸梗阻、先天性巨結(jié)腸和糖尿病胃輕癱等。ICC形態(tài)和/或數(shù)量的改變可能導(dǎo)致胃腸道動(dòng)力障礙。ICC具有可塑性,干細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以促使ICC表型恢復(fù)。因此,植入ICC或促使ICC形態(tài)和功能的恢復(fù),可用來(lái)治療某些胃腸動(dòng)力性疾病。近來(lái)研究表明,IL-9、NO和5-HT等可促進(jìn)ICC的生長(zhǎng)和發(fā)育。 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一種蛋白,其對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持具有重要的作用。NGF對(duì)損失神經(jīng)有再生修復(fù)的作用。于是我們假設(shè)：NGF可能促進(jìn)ICC的增殖,或者調(diào)節(jié)ICC起搏電流,從而影響胃腸道動(dòng)力。 目的 1.原代組織塊培養(yǎng)ICC,并進(jìn)行免疫熒光和亞甲藍(lán)鑒定。 2.研究NGF對(duì)原代培養(yǎng)ICC數(shù)量和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響。 3.研究NGF對(duì)原代培養(yǎng)ICC起搏電流和氯電流的調(diào)節(jié)。 方法 1.采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)ICC。取新生鼠近端空腸,仔細(xì)分離出平滑肌肌條,切成0.5x0.5mm2大小的組織塊。將組織塊置于含有圓形蓋玻片的12孔培養(yǎng)板,加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)ICC c-kit抗體的表達(dá),采用亞甲藍(lán)活染標(biāo)記培養(yǎng)ICC。 2.取成年小鼠,制備含縱形肌的肌片。采用亞甲藍(lán)活染標(biāo)記ICC,觀察ICC的形態(tài)、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及與神經(jīng)節(jié)的關(guān)系。 3.原代培養(yǎng)ICC,分為對(duì)照組和NGF組。NGF組在經(jīng)過(guò)12小時(shí)孵育后加入50 ng/ml的NGF。培養(yǎng)3天后,比較兩組ICC的生長(zhǎng)情況,觀察數(shù)量和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化。記錄ICC的起搏電流,比較兩組ICC起搏電流的幅度、頻率等特征。記錄ICC的外向整流性氯電流,研究該電流的特征,并比較兩組氯電流的幅度變化。 結(jié)果 1.培養(yǎng)3d后,在倒置顯微鏡下可見(jiàn)組織塊形成細(xì)胞界限清楚、層次明顯的細(xì)胞團(tuán)。典型的ICC出現(xiàn)胞體呈三角形,核大、胞質(zhì)少、胞體多突起、并有次級(jí)分支,細(xì)胞之間相互連接形成網(wǎng)絡(luò),相鄰平滑肌細(xì)胞呈梭形。直接免疫熒光染色后,在共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)ICC細(xì)胞c-Kit免疫熒光染色呈陽(yáng)性,細(xì)胞間相互聯(lián)系呈網(wǎng)絡(luò)狀。平滑肌細(xì)胞則為陰性。經(jīng)亞甲藍(lán)活染,外周ICC呈均勻深藍(lán)色,鏡下可見(jiàn)收縮運(yùn)動(dòng)。而神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞在成活狀態(tài)下均不著色。亞甲藍(lán)和c-kit抗體的共染表明,兩者具有同一性。 2.空腸腸管亞甲藍(lán)染色后,在解剖顯微鏡下可見(jiàn)ICC呈藍(lán)色或紫色,相互間形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。ICC沿神經(jīng)節(jié)主干邊緣分布,有少數(shù)細(xì)胞位于神經(jīng)節(jié)的上方。 3.免疫熒光的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,NGF組ICC的數(shù)量明顯增加。50 ng/mlNGF組明顯增加ICC量85%(均n=6)。亞甲藍(lán)標(biāo)記也呈相似結(jié)果。NGF組ICC的突起增多并連接呈致密網(wǎng)絡(luò)狀。在傳統(tǒng)的全細(xì)胞膜片鉗模式下,可記錄到節(jié)律性的內(nèi)向電流。NGF組內(nèi)向電流表現(xiàn)為節(jié)律性強(qiáng),波幅整齊,波形總體一致,起搏電流的幅度明顯增加(179.3±29 pA,n=6)。兩組內(nèi)向電流的頻率無(wú)明顯差異。兩組ICC都可以記錄到外向整流性氯電流。NGF組氯電流幅度明顯增加(850±140 pA,n=10),且出現(xiàn)明顯的內(nèi)向尾電流。 結(jié)論 1.我們采用組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)了ICC,并用免疫熒光技術(shù)和亞甲藍(lán)染色進(jìn)行了鑒定。亞甲藍(lán)染色是標(biāo)記ICC的一個(gè)很好的方法。我們?cè)诮M織水平對(duì)ICC進(jìn)行亞甲藍(lán)標(biāo)記,有助于對(duì)ICC進(jìn)行定位。 2.NGF能促進(jìn)原代培養(yǎng)ICC的增殖,并使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密。 3.NGF能增加原代培養(yǎng)ICC的起搏電流幅度。外向整流性氯電流為ICC起搏電流的主要成分,NGF能增加氯電流的幅度。 本課題的結(jié)果有助于進(jìn)一步探明胃腸動(dòng)力障礙性疾病的發(fā)病機(jī)制,并其為治療提供新的方向。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類(lèi)】：R574.4
【部分圖文】：

細(xì)胞沿著組織塊四周呈放射狀生長(zhǎng)(!100)"

2. 相差顯微鏡下典型的 CI C 形態(tài), 胞體呈三角形, 核大 ! 胞質(zhì)少 ! 胞體多突起細(xì)胞之間相互連接形成網(wǎng)絡(luò) (2x 0 ) "右上為高倍圖像 (x4O)O

泛!B 二圖4. 原代培養(yǎng) CI C 的亞甲藍(lán)活染 "A . 在成活狀態(tài)下亞甲藍(lán)選擇性標(biāo)記細(xì)胞團(tuán)中的Cja al 間質(zhì)細(xì)胞 (x40 );B. 亞甲藍(lán)選擇性標(biāo)記細(xì)胞團(tuán)四周的Caj la 間質(zhì)細(xì)胞 (4x 00)"圖 5. 亞甲藍(lán)與 c一ik t 同時(shí)標(biāo)記的C ja al 間質(zhì)細(xì)胞 "C 一ik t陽(yáng)性和亞甲藍(lán)著色細(xì)胞具有同一性 (x400) "

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Dissociation, culture and morphologic changes of interstitial cells of Cajal in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2005年18期

本文編號(hào)：2821861