發(fā)布時間：2020-09-18 15:58

　　 胃腸動力性疾病是一種由神經支配調節(jié)障礙所致的胃腸動力或感覺疾病,可能伴有內臟感知的異常。以神經胃腸病學為基礎,曼谷新分類按神經損害部位及動力異常特點進行分類,即是原發(fā)于胃腸神經元或肌源性動力病和繼發(fā)于全身器質性病的胃腸動力病。Cajal間質細胞(ICC)是胃腸道的一種問質細胞。ICC主要具有起搏功能和介導神經傳遞的作用,在胃腸動力的調節(jié)中起著重要的作用。ICC的形態(tài)改變、數(shù)量異常和網(wǎng)絡結構的改變與許多胃腸道動力疾病密切相關,如慢傳輸型便秘、假性腸梗阻、先天性巨結腸和糖尿病胃輕癱等。ICC形態(tài)和/或數(shù)量的改變可能導致胃腸道動力障礙。ICC具有可塑性,干細胞生長因子可以促使ICC表型恢復。因此,植入ICC或促使ICC形態(tài)和功能的恢復,可用來治療某些胃腸動力性疾病。近來研究表明,IL-9、NO和5-HT等可促進ICC的生長和發(fā)育。 神經生長因子(NGF)是神經營養(yǎng)因子家族的一種蛋白,其對中樞和外周神經系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持具有重要的作用。NGF對損失神經有再生修復的作用。于是我們假設：NGF可能促進ICC的增殖,或者調節(jié)ICC起搏電流,從而影響胃腸道動力。 目的 1.原代組織塊培養(yǎng)ICC,并進行免疫熒光和亞甲藍鑒定。 2.研究NGF對原代培養(yǎng)ICC數(shù)量和網(wǎng)絡結構的影響。 3.研究NGF對原代培養(yǎng)ICC起搏電流和氯電流的調節(jié)。 方法 1.采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)ICC。取新生鼠近端空腸,仔細分離出平滑肌肌條,切成0.5x0.5mm2大小的組織塊。將組織塊置于含有圓形蓋玻片的12孔培養(yǎng)板,加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。采用免疫組化技術檢測培養(yǎng)ICC c-kit抗體的表達,采用亞甲藍活染標記培養(yǎng)ICC。 2.取成年小鼠,制備含縱形肌的肌片。采用亞甲藍活染標記ICC,觀察ICC的形態(tài)、網(wǎng)絡結構及與神經節(jié)的關系。 3.原代培養(yǎng)ICC,分為對照組和NGF組。NGF組在經過12小時孵育后加入50 ng/ml的NGF。培養(yǎng)3天后,比較兩組ICC的生長情況,觀察數(shù)量和網(wǎng)絡結構的變化。記錄ICC的起搏電流,比較兩組ICC起搏電流的幅度、頻率等特征。記錄ICC的外向整流性氯電流,研究該電流的特征,并比較兩組氯電流的幅度變化。 結果 1.培養(yǎng)3d后,在倒置顯微鏡下可見組織塊形成細胞界限清楚、層次明顯的細胞團。典型的ICC出現(xiàn)胞體呈三角形,核大、胞質少、胞體多突起、并有次級分支,細胞之間相互連接形成網(wǎng)絡,相鄰平滑肌細胞呈梭形。直接免疫熒光染色后,在共聚焦顯微鏡下可見ICC細胞c-Kit免疫熒光染色呈陽性,細胞間相互聯(lián)系呈網(wǎng)絡狀。平滑肌細胞則為陰性。經亞甲藍活染,外周ICC呈均勻深藍色,鏡下可見收縮運動。而神經細胞、平滑肌細胞在成活狀態(tài)下均不著色。亞甲藍和c-kit抗體的共染表明,兩者具有同一性。 2.空腸腸管亞甲藍染色后,在解剖顯微鏡下可見ICC呈藍色或紫色,相互間形成網(wǎng)絡狀結構。ICC沿神經節(jié)主干邊緣分布,有少數(shù)細胞位于神經節(jié)的上方。 3.免疫熒光的結果顯示,與對照組相比,NGF組ICC的數(shù)量明顯增加。50 ng/mlNGF組明顯增加ICC量85%(均n=6)。亞甲藍標記也呈相似結果。NGF組ICC的突起增多并連接呈致密網(wǎng)絡狀。在傳統(tǒng)的全細胞膜片鉗模式下,可記錄到節(jié)律性的內向電流。NGF組內向電流表現(xiàn)為節(jié)律性強,波幅整齊,波形總體一致,起搏電流的幅度明顯增加(179.3±29 pA,n=6)。兩組內向電流的頻率無明顯差異。兩組ICC都可以記錄到外向整流性氯電流。NGF組氯電流幅度明顯增加(850±140 pA,n=10),且出現(xiàn)明顯的內向尾電流。 結論 1.我們采用組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)了ICC,并用免疫熒光技術和亞甲藍染色進行了鑒定。亞甲藍染色是標記ICC的一個很好的方法。我們在組織水平對ICC進行亞甲藍標記,有助于對ICC進行定位。 2.NGF能促進原代培養(yǎng)ICC的增殖,并使網(wǎng)絡結構更致密。 3.NGF能增加原代培養(yǎng)ICC的起搏電流幅度。外向整流性氯電流為ICC起搏電流的主要成分,NGF能增加氯電流的幅度。 本課題的結果有助于進一步探明胃腸動力障礙性疾病的發(fā)病機制,并其為治療提供新的方向。
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R574.4
【部分圖文】：

細胞沿著組織塊四周呈放射狀生長(!100)"

2. 相差顯微鏡下典型的 CI C 形態(tài), 胞體呈三角形, 核大 ! 胞質少 ! 胞體多突起細胞之間相互連接形成網(wǎng)絡 (2x 0 ) "右上為高倍圖像 (x4O)O

泛!B 二圖4. 原代培養(yǎng) CI C 的亞甲藍活染 "A . 在成活狀態(tài)下亞甲藍選擇性標記細胞團中的Cja al 間質細胞 (x40 );B. 亞甲藍選擇性標記細胞團四周的Caj la 間質細胞 (4x 00)"圖 5. 亞甲藍與 c一ik t 同時標記的C ja al 間質細胞 "C 一ik t陽性和亞甲藍著色細胞具有同一性 (x400) "

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Dissociation, culture and morphologic changes of interstitial cells of Cajal in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2005年18期

本文編號：2821861