第一部分肝細(xì)胞調(diào)控肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)肝再生機(jī)制研究研究背景和目的肝臟在遭受到外力損傷,化學(xué)毒物暴露,或者病毒感染時(shí),具有顯著的再生能力,來維持肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。肝再生是一個(gè)由不同種類的細(xì)胞共同參與的持續(xù)的自然過程。小鼠肝部分切除模型(Partial Hepatectomy,PHx)是用來研究肝再生最經(jīng)典的模型。在這個(gè)模型中,70%的肝臟被手術(shù)切除,剩下的肝臟增殖,大約術(shù)后1周,達(dá)到原來的肝臟體積,之后再生過程停止。肝再生是如何被觸發(fā)的,在再生過程中肝臟的結(jié)構(gòu)和功能是如何保持的,哪些信號(hào)負(fù)責(zé)關(guān)閉生長反應(yīng)是肝臟再生的三個(gè)主要問題。肝臟結(jié)構(gòu)主要由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(Liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)、肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)、Kupffer細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。肝細(xì)胞增殖在前,非實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生隨后。正常組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)過程中,星狀細(xì)胞在部分肝切除術(shù)后約4天產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì),重建肝細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的連接。肝內(nèi)血管系統(tǒng)主要由動(dòng)脈、靜脈和LSEC構(gòu)成。肝再生后期,勢(shì)必需要建立豐富的血管系統(tǒng)來維持新生肝細(xì)胞的存活,肝內(nèi)血管再生離不開肝臟內(nèi)特殊的毛細(xì)內(nèi)皮系統(tǒng)。LSECs約占肝臟內(nèi)細(xì)胞的15-20%,形成肝竇壁,參與了不同的生理和病理過程。肝細(xì)胞和LSECs的平衡對(duì)于肝再生穩(wěn)態(tài)的維持尤為重要,它有助于新生肝細(xì)胞的存活和肝臟功能保護(hù)。LSEC對(duì)肝細(xì)胞的增殖與終止是至關(guān)重要的,但啟動(dòng)LSEC的再生過程仍不清楚。研究方案1.檢測(cè)PHx后肝細(xì)胞與LSEC增殖的時(shí)相,探討導(dǎo)致兩者時(shí)相差的原因;2.論證CRISPR-Cas9聯(lián)合AAV技術(shù)用于肝再生研究的可行性;3.基于CRISPR-Cas9聯(lián)合AAV技術(shù)構(gòu)建特異性抑制肝細(xì)胞增殖的肝再生模型,觀察LSEC再生情況;4.篩查并驗(yàn)證肝細(xì)胞調(diào)控LSEC再生的關(guān)鍵因子,明確調(diào)控機(jī)理;5.探討肝細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮前體細(xì)胞分化形成LSEC的影響。研究結(jié)果1.發(fā)現(xiàn)肝再生中,肝細(xì)胞增殖高峰早于LSEC增殖高峰的可能原因;2.首次論證了CRISPR-Cas9技術(shù)用于肝再生研究的可行性。3.基于CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了肝細(xì)胞特異性敲除OSMR(OSMR~(ΔHep))和Met(Met~(ΔHep))的肝再生模型,發(fā)現(xiàn)抑制肝細(xì)胞增殖后,LSEC以及肝臟內(nèi)的血管再生滯緩,提示肝細(xì)胞啟動(dòng)了LSEC再生過程;4.肝切除術(shù)后分離肝臟中的肝細(xì)胞、HSC、Kupffer和LSEC,分別進(jìn)行了多因子篩查檢測(cè),對(duì)比分析顯示肝細(xì)胞中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的細(xì)胞因子VEGFA表達(dá)水平顯著上調(diào),而抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長的細(xì)胞因子PEDF表達(dá)水平顯著下調(diào);進(jìn)一步結(jié)合OSMR~(ΔHep)以及Met~(ΔHep)模型,提示了肝細(xì)胞可能通過上調(diào)VEGFA以及下調(diào)PEDF來促進(jìn)LSEC再生。5.體內(nèi)注射VEGFA中和抗體以及PEDF因子,可以顯著滯緩LSEC再生;6.肝細(xì)胞特異性敲除VEGFA(VEGFA~(ΔHep))的小鼠肝切除術(shù)后,LSEC增殖滯后;而它在LSEC、Kupffer以及HSC內(nèi)的敲除不影響肝體比恢復(fù)速率以及LSEC再生;肝細(xì)胞過表達(dá)PEDF(PEDF~(Hep))小鼠肝切除術(shù)后LSEC增殖滯后;以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)了肝細(xì)胞可通過上調(diào)VEGFA以及下調(diào)PEDF來促進(jìn)LSEC再生;7.結(jié)合內(nèi)皮前體細(xì)胞分析顯示,肝再生過程中,肝細(xì)胞可通過上調(diào)VEGFA及下調(diào)PEDF,促進(jìn)骨髓中CD133陽性的內(nèi)皮前體細(xì)胞動(dòng)員、定植入肝,分化形成LSEC過程。結(jié)論我們的研究發(fā)現(xiàn)了肝再生過程中肝細(xì)胞可啟動(dòng)LSEC再生,深入探討了肝細(xì)胞調(diào)控LSEC再生的方式,揭示了肝細(xì)胞影響骨髓CD133陽性內(nèi)皮前體細(xì)胞分化形成LSEC的機(jī)理。肝再生早期伴隨著肝細(xì)胞的快速增殖,肝細(xì)胞通過上調(diào)VEGFA同時(shí)下調(diào)PEDF(PHx后第2-3天),促進(jìn)LSEC的快速增殖;同時(shí)還促進(jìn)骨髓中CD133陽性的內(nèi)皮前體細(xì)胞,進(jìn)入血液中(PHx后第2-3天),定植肝內(nèi)(PHx后第2-4天),分化形成LSEC(PHx后第4-7天)。LSEC的部分再生過程依賴于骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞定植分化,本研究結(jié)果解釋了為什么VEGFA和PEDF在肝細(xì)胞內(nèi)變化高峰(PHx后第2-3天)與內(nèi)皮細(xì)胞增殖高峰(PHx后第4-5天)存在2-3天的時(shí)間差。第二部分靶向和非靶向線粒體型抗氧化劑在肝癌防治中的不同作用研究背景和目的肝臟具有的獨(dú)特快速再生能力,可避免在急/慢性損傷或肝細(xì)胞死亡后對(duì)肝臟正常功能的影響。然而,在慢性損傷的情況下,驅(qū)動(dòng)肝臟再生的分子機(jī)制是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變的主要危險(xiǎn)因素,這也解釋了肝細(xì)胞癌的發(fā)生通常伴有慢性肝病的基礎(chǔ),如肝硬化和慢性肝炎。伴隨著肝臟的損傷存在著持續(xù)的肝臟再生,其中,細(xì)胞積累活性氧簇與抗氧化調(diào)控失衡是導(dǎo)致致癌突變引發(fā)肝癌的主要原因之一。長久以來,人們普遍認(rèn)為抗氧化劑能夠中和活性氧(ROS)來減少氧化應(yīng)激產(chǎn)生的損傷,因此認(rèn)為抗氧化劑具有一定的預(yù)防和輔助治療腫瘤的作用。然而越來越多的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)以及基礎(chǔ)研究表明結(jié)果與此相反,即抗氧化劑對(duì)腫瘤不但沒有防治作用,甚至某些特殊情況下還會(huì)增加腫瘤罹患的風(fēng)險(xiǎn);這進(jìn)一步說明了抗氧化劑在腫瘤預(yù)防中的雙重作用,而且抗氧化劑對(duì)不同種類的腫瘤作用也不同。此外,循證醫(yī)學(xué)提示抗氧化劑的種類也是會(huì)影響腫瘤預(yù)防的效果�？傮w而言,為了合理地使用抗氧化劑,需要區(qū)分腫瘤類型以及抗氧化劑的種類。然而,使用不同種類的抗氧化劑對(duì)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生的結(jié)局仍然未知。本文綜合國內(nèi)外有關(guān)抗氧化劑在腫瘤預(yù)防和治療中的應(yīng)用和進(jìn)展,研究了靶向線粒體型抗氧化劑和非靶向型抗氧化劑在肝癌防治中的作用,分析了這兩類抗氧化劑促進(jìn)或抑制腫瘤的具體機(jī)制,并提出抗氧化劑的類型是影響其用于肝癌防治不同效應(yīng)的重要因素,從而為抗氧化劑在肝癌防治中的合理應(yīng)用提供了理論依據(jù)。研究方案1.建立DEN和DEN聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)的兩種肝癌模型,給予靶向線粒體型抗氧化劑和非靶向型抗氧化劑,研究兩類抗氧化劑對(duì)HCC形成的影響;2.檢測(cè)給予不同種類抗氧化劑后,肝細(xì)胞內(nèi)總ROS和線粒體內(nèi)ROS的變化情況,以明確這兩類抗氧化劑的作用部位;3.轉(zhuǎn)錄本測(cè)序分析抗氧化劑處理后肝臟樣本基因轉(zhuǎn)錄水平的變化;4.根據(jù)芯片數(shù)據(jù)探討抗氧化劑對(duì)肝細(xì)胞DNA損傷的影響和作用機(jī)制。5.檢測(cè)給予不同種類抗氧化劑后,DNA損傷,損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白以及修復(fù)相關(guān)蛋白在兩組之間的變化情況,明確調(diào)控機(jī)理;6.探討改變ATM/ATR活性對(duì)不同類型抗氧化劑防治HCC形成過程的影響。研究結(jié)果1.靶向線粒體型抗氧化劑(SS-31、Mito-Q)促進(jìn)HCC的形成,非靶向線粒體型抗氧化劑(NAC、Trolox)抑制HCC的形成;2.非靶向線粒體型抗氧化劑降低了細(xì)胞內(nèi)總的ROS;相比而言,靶向線粒體型抗氧化劑除降低細(xì)胞內(nèi)總的ROS外,還特異性降低了線粒體內(nèi)的ROS;3.轉(zhuǎn)錄本測(cè)序數(shù)據(jù)提示靶向和非靶向線粒體型抗氧化劑對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響不同,多條信號(hào)通路分析提示它們對(duì)DNA損傷反應(yīng)的影響不同;4.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)靶向線粒體型抗氧化劑促進(jìn)了肝細(xì)胞中DNA損傷,非靶向線粒體型抗氧化劑則抑制了該損傷;5.升高SS-31降低線粒體內(nèi)ROS,可以抑制SS-31所導(dǎo)致的DNA損傷;6.靶向和非靶向線粒體型抗氧化劑對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)DNA損傷反應(yīng)以及DNA修復(fù)相關(guān)蛋白影響不同;7.靶向線粒體型抗氧化劑抑制ATM/ATR及其下游信號(hào)通路,促進(jìn)ATM在線粒體內(nèi)富集,并減少核內(nèi)ATM分布;而非靶向線粒體型抗氧化劑進(jìn)一步活化該通路,促進(jìn)ATM核內(nèi)富集,減少線粒體內(nèi)ATM分布;8.改變ATM/ATR活性可逆轉(zhuǎn)不同類型抗氧化劑對(duì)HCC的防治效果。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)了靶向線粒體型抗氧化劑和非靶向線粒體型抗氧化劑對(duì)化學(xué)誘發(fā)肝癌的不同防治效果;揭示了非靶向線粒體型抗氧化劑NAC和Trolox可促進(jìn)原代肝細(xì)胞中DEN損傷的DNA修復(fù)過程,減緩了HCC形成;而靶向線粒體型抗氧化劑SS-31和Mito-Q則抑制了DNA修復(fù),促進(jìn)了HCC;闡述了靶向線粒體型抗氧化劑和非靶向線粒體型抗氧化劑在HCC防治中的不同作用與線粒體內(nèi)ROS和非線粒體內(nèi)ROS在HCC形成中的不同作用有關(guān),線粒體內(nèi)外ROS的失衡可能誘導(dǎo)了DNA損傷進(jìn)而促進(jìn)了HCC形成。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1 肝再生中肝細(xì)胞增殖高峰早于內(nèi)皮細(xì)胞增殖高峰。Figure 1. Hepatocytes proliferation is prior to LSECs after hepatectomy.A) Representative fluorescent microscopy of liver sections obtained from wide typice after partial hepatectomy (PHx). Hepatocytes were marked by HNF4α (red), live

圖 2 CRISPR-Cas9 技術(shù)在肝再生模型中有效性的驗(yàn)證Figure 2. The efficiency of CRISPR-Cas9 combined with adenovirous-associated virus(AAV) technology in liver regeneration mouse model.(A) Living body imaging of mice after injected with AAV.(B) Representative immunostaining of lucificanse in liver sections from Cas9-Alb-cre

圖 4 肝內(nèi)各類細(xì)胞群中的細(xì)胞因子經(jīng)篩查顯示，肝細(xì)胞來源的 VEGF 和 PEDF 調(diào)控了 LSEC 再生。Figure 4. Differential gene expression analysis of individual liver cell populationspresented hepatocyte-drived VEGF and PEDF to regulate LSEC proliferation.(A) qRT-PCR analysis of the biomarkers of isolated hepatocytes (Met), HSC (GFAP andDesmin), Kupffer (F4/80 and CD11b) or LSEC (Tie2 and VEGFR2) from wild type (WT)mice after PHx.(B) qRT-PCR analysis of the cytokines of promoting LSEC mitosis. VEGFA was thepossible cytokine. (n=4 animals)(C) qRT-PCR analysis of the cytokines of inhibiting LSEC mitosis. PEDF was thepossible cytokine.(D) qRT-PCR analysis of VEGFA and PEDF of isolated hepatocytes from WTOSMRΔHepand MetΔHepmice after PHx.(E) Quantification of VEGFA and PEDF by ELISA in liver sections from wild type miceafter PHx.

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