慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是指持續(xù)感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)超過6個(gè)月所引起的慢性肝臟炎癥性疾病。乙肝病毒的持續(xù)性感染是慢性乙肝疾病進(jìn)展的主要原因,但HBV感染并不會(huì)直接造成肝臟損傷,肝臟的炎癥性損傷是機(jī)體免疫系統(tǒng)清除HBV過程中形成的。HBV進(jìn)入肝細(xì)胞后,利用自身聚合酶將半環(huán)狀的病毒基因組以負(fù)鏈為模板進(jìn)行復(fù)制,形成閉合環(huán)狀的DNA(convalent close circular DNA,cccDNA),然后以cccDNA為模板進(jìn)行基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯,不斷形成新的病毒顆粒。cccDNA常與肝細(xì)胞中的核小體結(jié)合形成微染色體,抗病毒藥物治療難以將其徹底清除,cccDNA池是HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵,只有徹底清除肝細(xì)胞中的cccDNA才能實(shí)現(xiàn)CHB臨床治愈。免疫調(diào)節(jié)被認(rèn)為最有前景清除cccDNA的方式。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK細(xì)胞)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在機(jī)體抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,NK細(xì)胞在HBV慢性持續(xù)性感染過程中的表型和功能不同于急性感染,提示NK細(xì)胞可能在機(jī)體清除cccDNA過程中發(fā)揮作用。對(duì)CHB患者治療過程中NK細(xì)胞表型和功能的研究,有助于進(jìn)一步了解NK細(xì)胞在HBV慢性感染的作用,為臨床抗病毒療效的判斷和生物免疫治療提供思路,最大限度的長期抑制HBV DNA的復(fù)制,減輕肝細(xì)胞炎性壞死以及肝纖維化,延緩和減少肝功能衰竭、肝硬化失代償、HCC及其他并發(fā)癥的發(fā)生,從而改善生活質(zhì)量和延長生存時(shí)間。正如上面所述,乙型肝炎病毒的特殊性以及肝細(xì)胞損傷免疫機(jī)制的參與,說明僅僅抗病毒治療還不夠,必須同時(shí)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療,打破免疫耐受狀態(tài)更有利于抑制甚至清除病毒。已經(jīng)上市的抗乙肝病毒藥物有兩大類:核苷(酸)類似藥物(nucleos/tide analogues,NAs)和干擾素(interferon alpha,IFN-α),目前推薦的一線抗病毒藥物有恩替卡韋(enticavir,ETV)、替諾福韋酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)、替諾福韋艾拉酚胺富馬酸(Tenofovir alafenamide fumarate,TAF)和聚乙二醇干擾素(PegIFN-α)。NAs的單藥治療很難達(dá)到理想的治療目標(biāo)(HBsAg清除)和滿意的治療目標(biāo)(HBeAg清除);干擾素單藥治療副作用較大,PegIFN-α治療1年HBsAg清除率為3%。在我國ETV廣泛用于臨床。ETV是一種NAs,可通過與三磷酸脫氧鳥嘌呤核苷競爭,抑制HBV多聚酶的活性,臨床上主要應(yīng)用于病毒復(fù)制活躍,轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)升高的成年患者。《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》中指出,HBeAg陽性慢乙肝患者使用恩替卡韋單藥治療48周后,HBV DNA轉(zhuǎn)陰率為67%,HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為21%,轉(zhuǎn)氨酶復(fù)常率為68%;持續(xù)治療5年后HBV DNA轉(zhuǎn)陰率為94%,轉(zhuǎn)氨酶復(fù)常率為80%。恩替卡韋單藥治療很難實(shí)現(xiàn)HBs Ag陰轉(zhuǎn),有研究表明恩替卡韋治療1年未能觀察到HBsAg的清除。為了提高HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率和HBsAg清除率,達(dá)到滿意的和理想的治療目標(biāo),臨床需要不斷的探索新的治療方案,同時(shí)期待新的特效藥的研發(fā)上市。國內(nèi)一些學(xué)者在臨床上開展了核苷類抗病毒藥物聯(lián)合干擾素進(jìn)行序貫療法,療效不盡如人意。本文研究中,我們?cè)诔Ｒ?guī)ETV治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)治療CHB,以期待調(diào)節(jié)病人的免疫功能,提高HBe Ag和HBsAg的清除率。選擇臨床初診的HBeAg陽性CHB患者,隨機(jī)分成兩組,對(duì)照組(ETV組)服用ETV(0.5mg,qd);觀察組(ETV+GM組)在每天口服ETV(0.5 mg,qd)的基礎(chǔ)上,于治療第1周、第4周、第12周、第24周和第48周的第3、4、5天,給患者皮下注射100μg GM-CSF。定期檢測(cè)患者外周血中的HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT和中性粒細(xì)胞水平;分離患者外周血中的單個(gè)核細(xì)胞,利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD3-CD56+CD16+細(xì)胞中CD56、CD45RA、CD69的表達(dá)水平;純化外周血中的NK細(xì)胞,利用western blot方法檢測(cè)NK細(xì)胞中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路蛋白mTOR(Ser2448)、mTOR(7C10)、p70 S6K和4EBP-1等蛋白的磷酸化水平。本研究中,我們收集了22例ETV治療和24例ETV聯(lián)合GM-CSF治療慢乙肝患者(HBeAg陽性)的血液標(biāo)本和臨床資料。治療12周時(shí),ETV組中有2例HBV DNA陰轉(zhuǎn),陰轉(zhuǎn)率為9.1%,HBeAg均沒有轉(zhuǎn)陰;ETV+GM-CSF組有5例HBV DNA陰轉(zhuǎn),陰轉(zhuǎn)率為20.8%,3例HBeAg陰轉(zhuǎn)(陰轉(zhuǎn)率12.5%)。治療24周時(shí),ETV組有6例顯示HBV DNA陰轉(zhuǎn)(陰轉(zhuǎn)率27.3%),1例HBeAg陰轉(zhuǎn)(陰轉(zhuǎn)率4.5%);ETV+GM-CSF組有6例實(shí)現(xiàn)HBV DNA陰轉(zhuǎn)(陰轉(zhuǎn)率25%),HBeAg陰轉(zhuǎn)率還是12.5%。治療36周時(shí),ETV組有10例HBV DNA陰轉(zhuǎn)(陰轉(zhuǎn)率45.5%),2例HBeAg陰轉(zhuǎn)(陰轉(zhuǎn)率9.1%);ETV+GM-CSF組有11例實(shí)現(xiàn)HBV DNA陰轉(zhuǎn)(陰轉(zhuǎn)率45.8%),HBeAg有4例轉(zhuǎn)陰(陰轉(zhuǎn)率16.7%)。結(jié)果提示ETV+GM-CSF聯(lián)合抗病毒治療可以加快實(shí)現(xiàn)促進(jìn)HBeAg的清除。分離這些患者不同時(shí)間外周血中的單個(gè)核細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞(CD3-CD56+CD16+)比例,ETV組和ETV+GM-CSF組患者治療前外周血中的CD3-CD56+CD16+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的比例為11.86±2.20%和11.59±5.71%;治療12周時(shí)的比例為13.85±4.80%和11.28±4.96%;治療24周時(shí)的比例為12.79±3.14%和12.93±9.7%;治療36周時(shí)的比例為11.09±6.95%和12.47±3.49%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,兩組患者NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都沒有差異。患者外周血中CD3-CD56+CD16+細(xì)胞大都表達(dá)CD45RA分子。ETV組和ETV+GM-CSF組中CD45RA+CD69-NK細(xì)胞比例在第0、12、24和36周時(shí)分別是(29.18±21.76%vs 36.14±22.32%)、(35.00±32.44%vs 61.03±10.54%)、(51.30±28.32%vs 55.13±29.29%)、(87.45±4.2%vs 81.31±2.393%)。ETV組和ETV+GM-CSF組中CD45RA+CD69+NK細(xì)胞比例在第0、12、24和36周時(shí)分別是(67.27±20.99%vs 62.60±22.91%)、(58.71±32.46%vs43.10±28.16%)、(47.79±28.71%vs 35.81±12.08%)、(11.90±3.83%vs15.98±6.86%)。慢乙肝患者抗病毒治療后,CD45RA+CD69-NK細(xì)胞亞群比例升高,在治療12周時(shí),ETV+GM-CSF組患者外周血中的CD45RA+CD69-NK細(xì)胞比例顯著高于ETV組,說明GM-CSF可以促進(jìn)CD45RA+CD69-NK細(xì)胞的增殖(P=0.014)。隨著抗病毒治療的進(jìn)行,患者外周血中CD45RA+CD69+NK細(xì)胞頻數(shù)逐漸降低,血清中HBV DNA載量也逐漸下降,相關(guān)性分析表明HBV DNA下降與CD45RA+CD69+NK細(xì)胞頻數(shù)的降低有相關(guān)性。分離純化患者外周血中的NK細(xì)胞,檢測(cè)mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平。Western blot結(jié)果顯示,與HC組相比,ETV組和ETV+GM-CSF組患者的NK細(xì)胞內(nèi)mTOR(Ser2448)和p70 S6激酶的磷酸化水平升高,mTOR(7C10,Ser2481)和磷酸化的4EBP1的表達(dá)下調(diào)。與ETV組相比,ETV+GM-CSF組患者外周血中NK細(xì)胞mTOR(7C10,Ser2481)和磷酸化的4EBP1的表達(dá)上調(diào),磷酸化的p70 S6激酶水平下調(diào)。綜上所述,治療12周時(shí),ETV+GM-CSF聯(lián)合抗病毒治療可以加快慢乙肝患者外周血中的HBeAg陰轉(zhuǎn)率;增加外周血中CD3-CD56+CD16+細(xì)胞中CD45RA+CD69-亞群的比例,降低CD45RA+CD69+NK細(xì)胞頻數(shù);上調(diào)NK細(xì)胞mTOR(7C10)和4EBP1的磷酸化水平,下調(diào)mTOR(Ser2448)和p70 S6的磷酸化水平。
【學(xué)位單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 金燕;邱婷;呂頤菲;閻春英;王雪;段天嬌;張蓉;劉貴生;;拉米夫定和α-干擾素序貫治療對(duì)慢性乙肝患者細(xì)胞免疫功能以及血清中PD-1和Tin-3含量的影響[J];海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2016年14期

2 孫海霞;楊小安;張燁瓊;張卡;曹紅;李剛;徐啟桓;;聚乙二醇干擾素α-2a序貫替比夫定治療HBeAg陽性慢乙肝的短期療效與安全性[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2014年03期

本文編號(hào)：2820529