急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床的危重急癥,大多數(shù)患者是輕癥胰腺炎,且為自限性,通常在發(fā)病數(shù)日后可好轉(zhuǎn)；但仍有約20%-30%的患者表現(xiàn)為重癥急性胰腺炎。重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)以全身炎癥反應(yīng)綜合癥、多器官功能衰竭及胰腺局部并發(fā)癥為特征,盡管臨床治療方法不斷改善,但目前病死率仍高達(dá)15-30%。早期階段的多器官功能衰竭及后期感染等并發(fā)癥是導(dǎo)致重癥急性胰腺炎高死亡率的主要原因。多器官功能衰竭是全身性炎癥反應(yīng)的結(jié)果,值得注意的是過度激活的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞釋放的炎癥因子可能導(dǎo)致遠(yuǎn)處器官的損傷。在重癥急性胰腺炎的發(fā)病過程中,胰腺局部、以及全身性炎癥反應(yīng)發(fā)揮了重要作用。深入認(rèn)識和研究重癥急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)機制,對于其治療方法的探索一直是研究的熱點。 SAP的一個重要問題是尚沒有一個特異的血清學(xué)或者其他指標(biāo)來診斷和預(yù)測預(yù)后,進而指導(dǎo)治療。目前臨床上已有通過檢測血清淀粉酶和C-反應(yīng)蛋白等判斷SAP預(yù)后,但是應(yīng)用價值非常有限。 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(the receptor for advanced glycation end products, RAGE),屬于細(xì)胞表面分子免疫球蛋白超家族多配體受體成員,廣泛分布在單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體是介導(dǎo)HMGB1細(xì)胞因子活性的重要受體。除HMGB 1,其配體還包括糖基化終末產(chǎn)物、p淀粉樣肽、S100蛋白等。RAGE與其配體相互作用常導(dǎo)致快速持續(xù)的細(xì)胞活化和下游基因轉(zhuǎn)錄,多種細(xì)胞信號ERK1/2(p44/p42)、p38和SAPK/JNK MAP激酶,rho-GTP酶類,磷酸肌醇-3-激酶和JAK/STAT信號途徑在不同類型細(xì)胞中被激活,并通過核因子kappaB (Nuclear Factor-kappaB, NF-kB)持久活化維持和擴大炎癥反應(yīng)。有報道指出,RAGE敲除小鼠能耐受盲腸結(jié)扎穿孔引起的感染性休克,表明RAGE在系統(tǒng)性急性炎癥過程中發(fā)揮重要作用。 RAGE屬于單跨膜片段受體,分為胞外段、疏水的跨膜區(qū)和胞內(nèi)段3部分；其胞外部分包含了一個“V”型區(qū)和兩個“C”型區(qū),與HMGB1結(jié)合的主要部位位于N端的“V”型區(qū)。最近,在人類和小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)幾種RAGE的變異體,公認(rèn)的有可溶性RAGE(soluble RAGE, sRAGE)和內(nèi)源性分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE, esRAGE)。雖然它們的產(chǎn)生機制及分子大小不盡相同,但由于都包括配體結(jié)合的細(xì)胞外區(qū)域而缺乏跨膜區(qū)域,因此能與RAGE競爭同RAGE配體的結(jié)合,并阻斷RAGE信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)�？扇苄訰AGE(sRAGE)存在于循環(huán)中,由RAGE的胞外段構(gòu)成；sRAGE包括esRAGE和RAGE蛋白水解裂解的形式。在晚期腎臟疾病和急性肺損傷由sRAGE水平升高。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病、老年性癡呆和原發(fā)性高血壓中sRAGE水平降低。目前,有研究提示重癥急性胰腺炎是否合并器官衰竭時,sRAGE水平顯著不同。 高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1, HMGB1)是RAGE的主要配體之一,是一種DNA結(jié)合蛋白,又稱兩性蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳時的快速遷移而得名,是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一的能在細(xì)胞外誘導(dǎo)細(xì)胞因子和活化炎癥細(xì)胞的核內(nèi)蛋白。HMGB1具有3個結(jié)構(gòu)域,即A、B、C區(qū),A和B區(qū)主要構(gòu)成HMGB1的非特異性DNA結(jié)合區(qū)；C區(qū)可與其它蛋白相互作用來調(diào)節(jié)HMGB1與DNA的親和力。HMGB1分布十分廣泛,在多種器官組織(如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等)的細(xì)胞中均有表達(dá),它通過兩種不同的途徑釋放至細(xì)胞外：活化炎癥細(xì)胞的主動分泌和壞死細(xì)胞的被動釋放。最近的研究表明細(xì)胞外的HMGB1可作為一種晚期炎癥因子參與膿毒癥的病理生理,并且在重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatits, SAP)從全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)到多器官功能不全(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)、多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF)的過程中起到非常重要的作用。而且與其它促炎因子如腫瘤壞死因子-a (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)和白介素-1(interleukin-1, IL-1)不同,HMGB1具有出現(xiàn)晚,但持續(xù)時間長的特點,從而擴大了臨床治療的時間窗。 目前國內(nèi)外關(guān)于重癥急性胰腺炎與RAGE及其配體HMGB1的研究較少,為明確RAGE在重癥急性胰腺炎發(fā)病中的作用,我們擬建立大鼠重癥急性胰腺炎模型,觀察重癥急性胰腺炎造模成功后大鼠胰腺組織內(nèi)RAGE及其配體HMGB1在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的變化,同時通過ELISA法檢測血清中sRAGE和HMGB1這兩種炎癥因子水平。這一研究不僅為臨床治療重癥急性胰腺炎提供新的思路,而且也對其他有炎癥機制參與的急性損傷性疾病提供借鑒和參考。 一、大鼠重癥急性胰腺炎模型的建立 目的：制備SAP動物模型,了解大鼠SAP病程規(guī)律,為下一步實驗研究提供基礎(chǔ)。 方法：將64只雄性SD大鼠隨機分為8組,用生理鹽水配置20%L-精氨酸溶液,利用腹腔注射的方法,按照250mg/100g的劑量,間隔一小時重復(fù)注射一次,制備SAP模型,對照組SD大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模后6h,18h,24h,36h,48h,72h,96h分批處死大鼠,心臟采血,室溫靜置后離心分離血清,分裝后放置于-80℃冰箱低溫保存。同時留取胰腺、肝臟、肺臟、腸道組織。測定血清淀粉酶(serum amylase, AMY),染色觀察胰腺組織、肺臟病理學(xué)變化并評分。 結(jié)果：造模后6h起,血清淀粉酶水平就開始升高,其中SAP18h組血清淀粉酶水平顯著高于其他各組。大鼠SAP模型各時間點腹水量隨著病情進展逐漸增多,至SAP 96h組腹水量達(dá)到最高水平。光鏡下,對照組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰,腺泡結(jié)構(gòu)完整,小葉間隔清晰,有輕度水腫,無炎細(xì)胞浸潤及出血、壞死。大鼠造模后6h起,胰腺病理評分顯著升高,SAP 6h組胰腺組織出現(xiàn)間質(zhì)水腫,有輕、中度的炎細(xì)胞浸潤,以中性粒為主,腺泡結(jié)構(gòu)尚好,組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞。SAP18h組胰腺間質(zhì)顯著水腫,有大量炎細(xì)胞浸潤,有輕度的實質(zhì)壞死和出血。SAP 24h組胰腺腺泡細(xì)胞腫脹,可見灶性壞死,腺泡細(xì)胞間有大量炎癥細(xì)胞浸潤,胰腺實質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出較多,胰腺壞死、出血較18h明顯。SAP 36h組腺泡結(jié)構(gòu)破壞較多,小葉排列紊亂,其間充斥大量炎性滲出,壞死區(qū)內(nèi)腺泡結(jié)構(gòu)消失。SAP 48h組腺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,胰腺組織大片破壞,周圍脂肪組織明顯充血,大量炎癥細(xì)胞浸潤。SAP 72h組壞死加重,腺泡結(jié)構(gòu)消失,壞死區(qū)HE染色為粉紅色無結(jié)構(gòu)區(qū)域,胞核溶解,葉間隙增寬,間質(zhì)微血管破裂,大量紅細(xì)胞溢出,片狀脂肪壞死形成,可見皂化斑。SAP 96h組胰腺組織壞死達(dá)到最高程度。光鏡下,對照組大鼠肺泡壁完整,肺間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤,肺組織結(jié)構(gòu)清晰。SAP24h組肺臟間質(zhì)增寬,肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)淡紅色滲液,伴有肺泡萎縮,肺泡及間質(zhì)有大量中性粒細(xì)胞浸潤。SAP 36h組肺泡間質(zhì)明顯增寬,肺泡腔內(nèi)顯著充血、水腫,有大量炎細(xì)胞浸潤。SAP 48h、SAP 72h、SAP 96h組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁破裂,肺泡腔出血明顯,肺泡間隔顯著增寬,大部分肺泡和間質(zhì)中有中性粒細(xì)胞浸潤,結(jié)構(gòu)損害嚴(yán)重。 結(jié)論：腹腔注射20%L-精氨酸溶液制備大鼠重癥急性胰腺炎模型,具有操作簡便,快捷,對動物創(chuàng)傷性小,可重復(fù)性好,模型穩(wěn)定,成功率高等優(yōu)點,是一種較理想的模型,為進一步開展SAP致病機制相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。 二、RAGE在大鼠重癥急性胰腺炎中的表達(dá) 目的：研究大鼠SAP發(fā)病過程中胰腺組織中RAGE及血清中sRAGE含量變化的規(guī)律。 方法：按照各時間點處死大鼠,無菌條件下留取胰腺組織,抽提總mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增出大鼠RAGE,擴增產(chǎn)物與預(yù)期目的基因一致。用實時定量PCR (real-time PCR)的方法檢測胰腺組織RAGE mRNA表達(dá)；免疫組化法(Immunohistochemisty, IHC)檢測SAP不同時段組大鼠胰腺組織中RAGE蛋白表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent adsorption method, ELISA)檢測血清中sRAGE水平。 結(jié)果：實時定量PCR方法檢測RAGE在mRNA水平的表達(dá),統(tǒng)計結(jié)果顯示SAP 6h組、SAP 18h組、SAP 24h組、SAP36h組、SAP 48h組、SAP 72h組及SAP 96h組RAGE在胰腺組織中的相對表達(dá)量顯著高于對照組(P0.05),其中SAP 24h組及SAP 36h組RAGE在胰腺組織中的相對表達(dá)量顯著高于其他時相組(P0.05),之后有降低趨勢。IHC從蛋白水平顯示SAP 48h組胰腺組織炎癥細(xì)胞胞膜及胞漿中有RAGE的表達(dá),對照組無表達(dá)。本實驗還通過RAGE ELISA試劑盒測定血清中sRAGE含量,結(jié)果顯示對照組血清中sRAGE濃度較低,SAP 6h組sRAGE濃度開始升高,與對照組比較有明顯差異(P0.05)；SAP18h組sRAGE濃度明顯升高,SAP 24h組sRAGE濃度達(dá)峰值,與其他各組相比有顯著差異(P0.05)；24h后,血清中sRAGE濃度開始下降,但SAP 36h組及SAP 48h組sRAGE濃度仍維持在相對較高的水平,SAP 96h組sRAGE濃度下降至接近基線水平,與對照組相比差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：RAGE在重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用,組織和血清中的RAGE表達(dá)呈時間依賴性,血清中RAGE的表達(dá)可部分反映SAP的病程。 三、HMGB1在大鼠重癥急性胰腺炎中的表達(dá) 目的：研究大鼠SAP發(fā)病過程中胰腺組織及血清中RAGE配體HMGB1蛋白的變化規(guī)律 方法：按照各時間點處死大鼠,無菌條件下留取胰腺組織,抽提總mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增出大鼠HMGB1,擴增產(chǎn)物與預(yù)期目的基因一致。用real-time PCR的方法檢測胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)；IHC檢測SAP不同時段組大鼠胰腺組織中HMGB1蛋白表達(dá)；采用ELISA檢測血清中HMGB1水平。 結(jié)果：實時定量PCR方法檢測HMGB1在mRNA水平的表達(dá),統(tǒng)計結(jié)果顯示SAP 6h組、SAP18h組、SAP 24h組、SAP 36h組、SAP 48h組、SAP 72h組及SAP 96h組HMGB1在胰腺組織中的相對表達(dá)量顯著高于對照組(P0.05,),其中SAP 36h組HMGB1在胰腺組織中的相對表達(dá)量顯著高于其他組(P0.05)。IHC從蛋白水平顯示SAP 36h組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞及炎癥細(xì)胞胞漿、胞核及胰腺間質(zhì)中有HMGB1蛋白表達(dá),對照組無表達(dá)。本實驗還通過HMGB1 ELISA試劑盒測定血清中HMGB1含量,結(jié)果顯示對照組血清中HMGB1濃度較低,SAP 6h組HMGB1濃度開始升高,與對照組比較有明顯差異(P0.05)；SAP18h組及SAP 24h組HMGB1濃度明顯升高,SAP36h組HMGB1濃度達(dá)峰值,與其他各組相比有顯著差異(P0.05)；36h后,血清中HMGB1濃度開始下降,但SAP 48h組及SAP 72h組HMGB1濃度仍維持在相對較高的水平,SAP 96h組HMGB1濃度下降至接近基線水平,與對照組相比差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：HMGB1可能作為晚期炎癥因子參與了重癥急性胰腺炎的全身炎癥反應(yīng),且其在血清中出現(xiàn)的時相晚于其受體RAGE。 通過上述研究,本課題得出以下結(jié)論： 1、通過腹腔注射L-精氨酸成功建立重癥急性胰腺炎大鼠模型。 2、RAGE在重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用,組織和血清中的RAGE表達(dá)呈時間依賴性,血清中RAGE的表達(dá)可部分反映SAP的病程。 3、HMGB1可能作為晚期炎癥因子參與了重癥急性胰腺炎的全身炎癥反應(yīng),且其在血清中出現(xiàn)的時相晚于其受體RAGE,二者有望作為SAP的診斷標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R576
【部分圖文】：

此后逐漸降低至正常水平，反應(yīng)淀粉酶的高低與疾病輕重程度并非線性關(guān)系。SAP組大鼠腹水量的變化與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。血清淀粉酶及腹水量的變化如下(表1一1，圖1一1，圖1一2)

(二)大體觀察結(jié)果對照組大鼠胰腺組織呈淡粉紅色，均勻一致，組織柔軟，光澤度好，膽胰管清晰可見，未見明顯腹水及皂化斑，見圖1一3。 SAP6h、18h組胰腺輪廓模糊，局部有散在少量出血改變;腹腔內(nèi)可見中等量淡黃色腹水，未見皂化斑;肺臟、肝臟及腸道無明顯變化。 SAP24h、36h組胰腺輪廓不清，廣泛出血，可見散在分布的暗紅色點灶狀壞死;腹腔內(nèi)可見大量淺紅色腹水，胰腺、胰周可見皂化斑并伴胃儲留;出現(xiàn)肺水腫伴淤血，肝臟充血，腸道輕度腫脹。 SAP48h、72h、%h胰腺輪廓消失，出血壞死嚴(yán)重，可見廣泛分布的暗紅色壞死灶，胰腺組織變薄;腹腔內(nèi)可見大量血性腹水;胰腺、胰周及腸系膜根部可見大量皂化斑;肺部有明顯的出血點

)病理組織分析及評分結(jié)果、胰腺組織病理分析及評分鏡卜，對照紅{.胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡結(jié)構(gòu)完整，小葉間隔清晰，肩細(xì)胞浸潤及出」fll.、壞死。見圖1一6。SAP6h組胰腺組織出現(xiàn)間質(zhì)水的炎細(xì)胞浸i閏，以中性粒為卜，腺泡結(jié)構(gòu)尚好，組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞腺間質(zhì)顯著水腫，有大量炎細(xì)胞浸潤，有輕度的實質(zhì)壞死和出血.。S泡細(xì)胞腫脹，，丁見灶性壞死，腺泡細(xì)胞間有大量炎癥細(xì)胞浸i閏，胰腺出較多，胰腺壞死、出血較18h組明顯。SAP36hiJI腺泡結(jié)構(gòu)破壞較亂，其間充斥大量炎性滲出，壞死區(qū)內(nèi)腺泡結(jié)構(gòu)消失。SAP48h組腺，胰腺組織大片破壞，周圍脂肪組織明顯充血，大量炎癥細(xì)胞浸潤。S重，月泉泡結(jié)構(gòu)消失，壞死區(qū)HE染色為粉紅色無結(jié)構(gòu)1火_域，胞核溶解，間質(zhì)微血帶破裂，大量紅細(xì)胞溢出，片狀脂肪壞死形成，、可見皂化斑

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳建敏;周亞濱;程軼U

本文編號：2820211