背景:非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前最常見的肝臟疾病,是其它慢性肝病的形成主要原因,NAFLD進(jìn)一步發(fā)展會(huì)導(dǎo)致非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生。在世界范圍內(nèi),NAFLD患病率約為25%,其中南美洲(31%)和中東(32%)發(fā)病率最高,其次是亞洲(27%),美國(guó)(24%)和歐洲(23%);而NAFLD在非洲比較少見(14%)。該病是一種與肥胖、糖尿病密切相關(guān)的慢性肝臟疾病,在中國(guó)的發(fā)病率高達(dá)15-20%,對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成沉重負(fù)擔(dān)。目前尚無(wú)用于治療NAFLD的藥物,因此深入研究NAFLD發(fā)病機(jī)制,開發(fā)相關(guān)藥物成為了一個(gè)重要的課題。蛋白激酶G(PKG)是絲氨酸/酪氨酸特異性激酶,是cGMP信號(hào)的主要作用因子。在轉(zhuǎn)錄水平上,一系列因子被發(fā)現(xiàn)對(duì)PKG1的表達(dá)具有調(diào)控作用,如Sp1/Sp3,KLF4,p53,FoxO1,USF1/2和RhoA等,它們大多與NO/環(huán)核苷酸途經(jīng)相關(guān)。我們以前的研究證實(shí),過(guò)表達(dá)蛋白激酶G-1(PKG-1)能調(diào)節(jié)高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂質(zhì)代謝,降低脂質(zhì)在小鼠體內(nèi)的儲(chǔ)積,而肥胖常常伴隨著NAFLD的發(fā)生,但是PKG-1對(duì)NAFLD的作用機(jī)制尚不明確,因此本研究應(yīng)用小鼠單純肥胖并發(fā)晚期糖尿病動(dòng)物模型,通過(guò)生物化學(xué)與分子生物學(xué)的技術(shù)手段對(duì)PKG1基因調(diào)控非酒精性脂肪肝的效應(yīng)及分子機(jī)理進(jìn)行研究,為研究開發(fā)與PKG1相關(guān)的治療NAFLD的藥物提供實(shí)驗(yàn)支持。目的:探索PKG-1對(duì)非酒精性脂肪肝的作用及其作用機(jī)制。方法:1.小鼠脂肪肝模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)小鼠分為四組:ob~(-/-)CD~+組、ob~(+/-)CD~+組、ob~(-/-)CD~-組和ob~(-/-)CD~-組。ob~(-/-)組小鼠為obese基因隱形純合小鼠,該小鼠食物攝入量大,易肥胖,是常作II型糖尿病研究的動(dòng)物模型。ob~(+/-)小鼠為ob~(-/-)小鼠與野生型小鼠雜交繁育而成。CD~+組小鼠為PKG-1基因過(guò)表達(dá)的小鼠,為美國(guó)肯塔基大學(xué)營(yíng)養(yǎng)學(xué)院王淑霞教授實(shí)驗(yàn)室原有小鼠,通過(guò)CD~+小鼠與ob~(-/-)小鼠雜交獲得,經(jīng)過(guò)基因型鑒定后分為ob~(-/-)CD~+、ob~(+/-)CD~+、ob~(-/-)CD~-和ob~(+/-)CD~-四組小鼠,選擇每組6只雌性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.小鼠肝臟稱重及肝臟指數(shù)的計(jì)算在小鼠20周齡時(shí)稱取小鼠的體重,解剖小鼠并稱取肝臟的濕重,用小鼠的肝臟重量除以小鼠體重得出肝臟指數(shù)。3.小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察小鼠肝臟組織用10%的福爾馬林固定后,石蠟包埋,在制成石蠟切片后進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察肝臟組織的結(jié)構(gòu);肝臟組織的纖維化程度是通過(guò)masson染色和Sirius red染色后,顯微鏡下觀察膠原纖維的分布來(lái)確定的。4.小鼠肥胖及纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)采用qPCR方法檢測(cè)與脂肪合成降解相關(guān)基因,如CPT1A、PGC1α、PPAR GAMA、SREBP和FASN,及纖維化相關(guān)基因,如CollagenI/III/IV、TGF-b、Fibronectin的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果:1.PKG-1過(guò)表達(dá)可以明顯改善小鼠脂肪肝程度。在ob~(-/-)純合肥胖模型中,過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠與非過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠相比,體重與肝指數(shù)均顯著降低,TG與蛋白總含量比值也顯著降低。HE染色表明,過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠與非過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠相比,脂肪空泡明顯減少,且肝臟組織結(jié)構(gòu)較為完整。以上結(jié)果表明,PKG-1過(guò)表達(dá)可以顯著改善肥胖模型小鼠的脂肪肝程度。2.PKG-1過(guò)表達(dá)下調(diào)脂肪降解、脂肪合成及游離脂肪酸吸收的相關(guān)基因表達(dá)。在肥胖模型中,過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠與非過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠相比,脂肪氧化分解的相關(guān)基因CPT1a與PGC1α,脂肪合成的相關(guān)基因PPAR GAMA、SREBP和FASN,游離脂肪酸吸收的相關(guān)基因CD36、FATP2和FATP5,均顯著下調(diào)。說(shuō)明PKG-1過(guò)表達(dá)調(diào)控下游脂肪降解、合成及游離脂肪酸吸收的轉(zhuǎn)換過(guò)程。3.PKG-1過(guò)表達(dá)減弱了肝臟細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)。在肥胖模型中,過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠與非過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠相比,炎癥因子IL-6和TNF-α均顯著下調(diào)。過(guò)表達(dá)PKG-1引起炎癥反應(yīng)減弱可能與脂肪減少相關(guān)。4.PKG-1過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制肝臟組織纖維化。在肥胖模型小鼠中,與非過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠相比,過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠肝臟組織中的膠原染色較弱。另外肝細(xì)胞纖維化相關(guān)基因CollagenI/III/IV和Fibronectin,與非過(guò)表達(dá)PKG-1小鼠比,PKG-1過(guò)表達(dá)組小鼠肝臟中的上述基因表達(dá)水平顯著降低。以上結(jié)果表明,PKG-1過(guò)表達(dá)顯著抑制肝臟組織的纖維化。結(jié)論:1.在obese基因缺失組小鼠中,PKG-1過(guò)表達(dá)顯著降低非酒精性脂肪肝的脂肪積累水平。2.過(guò)表達(dá)PKG-1可以改善肝臟纖維化的程度。3.過(guò)表達(dá)PKG-1可能通過(guò)降低肝臟炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)非酒精性脂肪肝。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

2.1 PKG-1 過(guò)表達(dá)降低肥胖小鼠肝臟脂肪含量我們通過(guò)帶有隱形純合子 ob 基因(ob-/-)的小鼠建立單純肥胖模型，解剖后與 ob 基因雜合子小鼠的體重、肝臟重量、肝指數(shù)相比較，結(jié)果如圖 2.1 所示，ob-/-小鼠的肝臟重量明顯高于 ob+/-小鼠肝臟的的重量（a），ob-/-小鼠的肝指數(shù)明顯高于 ob+/-小鼠的肝指數(shù)（b），ob-/-小鼠肝臟中 TG 與蛋白總量的百分比顯著高于 ob+/-小鼠的百分比（c）。因此，ob-/-小鼠組肝臟脂肪含量高于 ob+/-小鼠。在 ob-/-小鼠中分別有 PKG-1 過(guò)表達(dá)組（CD+）和非過(guò)表達(dá) PKG-1 組（CD-），對(duì)該兩組小鼠的肝臟稱重并除以相應(yīng)小鼠的體重，我們發(fā)現(xiàn) CD+組小鼠的肝重與肝指數(shù)明顯低于 CD-組小鼠，說(shuō)明 PKG-1 過(guò)表達(dá)在小鼠肝臟脂肪含量降低過(guò)程中具有重要作用，如圖 2.1（a）和（b）。通過(guò)提取并測(cè)定 ob-/-小鼠中CD+組小鼠和 CD-組小鼠肝臟 TG 含量，發(fā)現(xiàn) CD+組小鼠的 TG 含量與蛋白總量百分比顯著低于 CD-組小鼠（c）。但是，ob+/-小鼠中，無(wú)論 PKG-1 基因是否過(guò)表達(dá)，對(duì)肝指數(shù)和肝臟中 TG/蛋白含量的影響并不明顯。

PKG-1 對(duì)非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用小鼠的肝臟重量、肝指數(shù)、TG/蛋白百分比明顯低于 CD-組小鼠。*P<0.05 PKG-1 過(guò)表達(dá)對(duì)肥胖誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝有明顯改善作肝臟組織切片進(jìn)行 HE 染色后，顯微照片顯示 ob-/-組小鼠肝臟中ob+/-組小鼠的，多數(shù)肝臟細(xì)胞的細(xì)胞核位于一側(cè)，這是細(xì)胞核被脂滴色時(shí)脂肪被溶解，肝臟細(xì)胞脂滴形成的空泡很干凈，可以清晰地 2.2）。對(duì)比 ob-/-組小鼠中，ob--CD+小鼠的脂肪空泡明顯少于 ob--結(jié)構(gòu)較為完整。在 ob+/-組小鼠中，ob+-CD+小鼠和 ob+-CD-小鼠整整，很少出現(xiàn)脂肪空泡（圖 2.2）。O

2.3.1 PKG-1 過(guò)表達(dá)對(duì)肝臟脂肪β-氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響脂肪氧化分解可以降低肝臟中脂肪的含量，脂肪β-氧化是生物體內(nèi)常見的一種氧化機(jī)制，在脂肪β-氧化過(guò)程中 CPT1A、PGC1α的表達(dá)量是一個(gè)及其重要直觀的評(píng)價(jià)因素。在小鼠體細(xì)胞中，CPT1A、PGC1α的表達(dá)量增加，可以增加肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4 的表達(dá)從而增強(qiáng)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且增加脂肪酸氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性使脂肪酸β-氧化速率增加。CPT1A 是肉堿依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體膜內(nèi)的關(guān)鍵酶，其缺乏導(dǎo)致脂肪酸β氧化率降低。如圖2.3.1 所示，qPCR 測(cè)定小鼠肝臟細(xì)胞 CPT1A、PGC1α基因的表達(dá)，結(jié)果表明，在 ob-/-且 PKG-1 過(guò)表達(dá)組小鼠 CPT1A、PGC1α 相對(duì)表達(dá)量有明顯差異。ob-/-組小鼠中，CD+組小鼠，CPT1A 表達(dá)量低于 CD-組小鼠，PGC1α表達(dá)量低于 CD-組小鼠。在 ob+/-小鼠組中 CPT1a、PGC1α表達(dá)量無(wú)顯著差別。在 ob-/-組小鼠中 CD+組小鼠 CPT1A 表達(dá)量低于CD-組小鼠，PGC1α表達(dá)量低于 CD-組小鼠，說(shuō)明 PKG-1 的過(guò)表達(dá)對(duì)脂肪β-氧化有抑制作用，但是在 ob+/-組小鼠中，CPT1A 和 PGC1α的表達(dá)無(wú)顯著差異。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2820401