背景:非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前最常見的肝臟疾病,是其它慢性肝病的形成主要原因,NAFLD進一步發(fā)展會導(dǎo)致非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生。在世界范圍內(nèi),NAFLD患病率約為25%,其中南美洲(31%)和中東(32%)發(fā)病率最高,其次是亞洲(27%),美國(24%)和歐洲(23%);而NAFLD在非洲比較少見(14%)。該病是一種與肥胖、糖尿病密切相關(guān)的慢性肝臟疾病,在中國的發(fā)病率高達15-20%,對國民經(jīng)濟發(fā)展造成沉重負擔。目前尚無用于治療NAFLD的藥物,因此深入研究NAFLD發(fā)病機制,開發(fā)相關(guān)藥物成為了一個重要的課題。蛋白激酶G(PKG)是絲氨酸/酪氨酸特異性激酶,是cGMP信號的主要作用因子。在轉(zhuǎn)錄水平上,一系列因子被發(fā)現(xiàn)對PKG1的表達具有調(diào)控作用,如Sp1/Sp3,KLF4,p53,FoxO1,USF1/2和RhoA等,它們大多與NO/環(huán)核苷酸途經(jīng)相關(guān)。我們以前的研究證實,過表達蛋白激酶G-1(PKG-1)能調(diào)節(jié)高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂質(zhì)代謝,降低脂質(zhì)在小鼠體內(nèi)的儲積,而肥胖常常伴隨著NAFLD的發(fā)生,但是PKG-1對NAFLD的作用機制尚不明確,因此本研究應(yīng)用小鼠單純肥胖并發(fā)晚期糖尿病動物模型,通過生物化學與分子生物學的技術(shù)手段對PKG1基因調(diào)控非酒精性脂肪肝的效應(yīng)及分子機理進行研究,為研究開發(fā)與PKG1相關(guān)的治療NAFLD的藥物提供實驗支持。目的:探索PKG-1對非酒精性脂肪肝的作用及其作用機制。方法:1.小鼠脂肪肝模型的建立及實驗分組實驗小鼠分為四組:ob~(-/-)CD~+組、ob~(+/-)CD~+組、ob~(-/-)CD~-組和ob~(-/-)CD~-組。ob~(-/-)組小鼠為obese基因隱形純合小鼠,該小鼠食物攝入量大,易肥胖,是常作II型糖尿病研究的動物模型。ob~(+/-)小鼠為ob~(-/-)小鼠與野生型小鼠雜交繁育而成。CD~+組小鼠為PKG-1基因過表達的小鼠,為美國肯塔基大學營養(yǎng)學院王淑霞教授實驗室原有小鼠,通過CD~+小鼠與ob~(-/-)小鼠雜交獲得,經(jīng)過基因型鑒定后分為ob~(-/-)CD~+、ob~(+/-)CD~+、ob~(-/-)CD~-和ob~(+/-)CD~-四組小鼠,選擇每組6只雌性小鼠進行實驗。2.小鼠肝臟稱重及肝臟指數(shù)的計算在小鼠20周齡時稱取小鼠的體重,解剖小鼠并稱取肝臟的濕重,用小鼠的肝臟重量除以小鼠體重得出肝臟指數(shù)。3.小鼠肝臟組織形態(tài)學觀察小鼠肝臟組織用10%的福爾馬林固定后,石蠟包埋,在制成石蠟切片后進行HE染色,顯微鏡下觀察肝臟組織的結(jié)構(gòu);肝臟組織的纖維化程度是通過masson染色和Sirius red染色后,顯微鏡下觀察膠原纖維的分布來確定的。4.小鼠肥胖及纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測采用qPCR方法檢測與脂肪合成降解相關(guān)基因,如CPT1A、PGC1α、PPAR GAMA、SREBP和FASN,及纖維化相關(guān)基因,如CollagenI/III/IV、TGF-b、Fibronectin的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果:1.PKG-1過表達可以明顯改善小鼠脂肪肝程度。在ob~(-/-)純合肥胖模型中,過表達PKG-1小鼠與非過表達PKG-1小鼠相比,體重與肝指數(shù)均顯著降低,TG與蛋白總含量比值也顯著降低。HE染色表明,過表達PKG-1小鼠與非過表達PKG-1小鼠相比,脂肪空泡明顯減少,且肝臟組織結(jié)構(gòu)較為完整。以上結(jié)果表明,PKG-1過表達可以顯著改善肥胖模型小鼠的脂肪肝程度。2.PKG-1過表達下調(diào)脂肪降解、脂肪合成及游離脂肪酸吸收的相關(guān)基因表達。在肥胖模型中,過表達PKG-1小鼠與非過表達PKG-1小鼠相比,脂肪氧化分解的相關(guān)基因CPT1a與PGC1α,脂肪合成的相關(guān)基因PPAR GAMA、SREBP和FASN,游離脂肪酸吸收的相關(guān)基因CD36、FATP2和FATP5,均顯著下調(diào)。說明PKG-1過表達調(diào)控下游脂肪降解、合成及游離脂肪酸吸收的轉(zhuǎn)換過程。3.PKG-1過表達減弱了肝臟細胞中的炎癥反應(yīng)。在肥胖模型中,過表達PKG-1小鼠與非過表達PKG-1小鼠相比,炎癥因子IL-6和TNF-α均顯著下調(diào)。過表達PKG-1引起炎癥反應(yīng)減弱可能與脂肪減少相關(guān)。4.PKG-1過表達能夠顯著抑制肝臟組織纖維化。在肥胖模型小鼠中,與非過表達PKG-1小鼠相比,過表達PKG-1小鼠肝臟組織中的膠原染色較弱。另外肝細胞纖維化相關(guān)基因CollagenI/III/IV和Fibronectin,與非過表達PKG-1小鼠比,PKG-1過表達組小鼠肝臟中的上述基因表達水平顯著降低。以上結(jié)果表明,PKG-1過表達顯著抑制肝臟組織的纖維化。結(jié)論:1.在obese基因缺失組小鼠中,PKG-1過表達顯著降低非酒精性脂肪肝的脂肪積累水平。2.過表達PKG-1可以改善肝臟纖維化的程度。3.過表達PKG-1可能通過降低肝臟炎癥反應(yīng)來保護非酒精性脂肪肝。
【學位單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

2.1 PKG-1 過表達降低肥胖小鼠肝臟脂肪含量我們通過帶有隱形純合子 ob 基因(ob-/-)的小鼠建立單純肥胖模型，解剖后與 ob 基因雜合子小鼠的體重、肝臟重量、肝指數(shù)相比較，結(jié)果如圖 2.1 所示，ob-/-小鼠的肝臟重量明顯高于 ob+/-小鼠肝臟的的重量（a），ob-/-小鼠的肝指數(shù)明顯高于 ob+/-小鼠的肝指數(shù)（b），ob-/-小鼠肝臟中 TG 與蛋白總量的百分比顯著高于 ob+/-小鼠的百分比（c）。因此，ob-/-小鼠組肝臟脂肪含量高于 ob+/-小鼠。在 ob-/-小鼠中分別有 PKG-1 過表達組（CD+）和非過表達 PKG-1 組（CD-），對該兩組小鼠的肝臟稱重并除以相應(yīng)小鼠的體重，我們發(fā)現(xiàn) CD+組小鼠的肝重與肝指數(shù)明顯低于 CD-組小鼠，說明 PKG-1 過表達在小鼠肝臟脂肪含量降低過程中具有重要作用，如圖 2.1（a）和（b）。通過提取并測定 ob-/-小鼠中CD+組小鼠和 CD-組小鼠肝臟 TG 含量，發(fā)現(xiàn) CD+組小鼠的 TG 含量與蛋白總量百分比顯著低于 CD-組小鼠（c）。但是，ob+/-小鼠中，無論 PKG-1 基因是否過表達，對肝指數(shù)和肝臟中 TG/蛋白含量的影響并不明顯。

PKG-1 對非酒精性脂肪肝的保護作用小鼠的肝臟重量、肝指數(shù)、TG/蛋白百分比明顯低于 CD-組小鼠。*P<0.05 PKG-1 過表達對肥胖誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝有明顯改善作肝臟組織切片進行 HE 染色后，顯微照片顯示 ob-/-組小鼠肝臟中ob+/-組小鼠的，多數(shù)肝臟細胞的細胞核位于一側(cè)，這是細胞核被脂滴色時脂肪被溶解，肝臟細胞脂滴形成的空泡很干凈，可以清晰地 2.2）。對比 ob-/-組小鼠中，ob--CD+小鼠的脂肪空泡明顯少于 ob--結(jié)構(gòu)較為完整。在 ob+/-組小鼠中，ob+-CD+小鼠和 ob+-CD-小鼠整整，很少出現(xiàn)脂肪空泡（圖 2.2）。O

2.3.1 PKG-1 過表達對肝臟脂肪β-氧化相關(guān)基因表達的影響脂肪氧化分解可以降低肝臟中脂肪的含量，脂肪β-氧化是生物體內(nèi)常見的一種氧化機制，在脂肪β-氧化過程中 CPT1A、PGC1α的表達量是一個及其重要直觀的評價因素。在小鼠體細胞中，CPT1A、PGC1α的表達量增加，可以增加肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運子-4 的表達從而增強葡萄糖的轉(zhuǎn)運，并且增加脂肪酸氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性使脂肪酸β-氧化速率增加。CPT1A 是肉堿依賴性轉(zhuǎn)運線粒體膜內(nèi)的關(guān)鍵酶，其缺乏導(dǎo)致脂肪酸β氧化率降低。如圖2.3.1 所示，qPCR 測定小鼠肝臟細胞 CPT1A、PGC1α基因的表達，結(jié)果表明，在 ob-/-且 PKG-1 過表達組小鼠 CPT1A、PGC1α 相對表達量有明顯差異。ob-/-組小鼠中，CD+組小鼠，CPT1A 表達量低于 CD-組小鼠，PGC1α表達量低于 CD-組小鼠。在 ob+/-小鼠組中 CPT1a、PGC1α表達量無顯著差別。在 ob-/-組小鼠中 CD+組小鼠 CPT1A 表達量低于CD-組小鼠，PGC1α表達量低于 CD-組小鼠，說明 PKG-1 的過表達對脂肪β-氧化有抑制作用，但是在 ob+/-組小鼠中，CPT1A 和 PGC1α的表達無顯著差異。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2820401