研究背景:肝纖維化是肝硬化的前期病理階段,是肝臟受到慢性損傷時,細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)可逆性沉積的創(chuàng)傷愈合過程。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纖維化形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是肝纖維化時ECM的主要來源細胞,因此促進活化HSC的凋亡成為阻斷肝纖維化的重要策略。我們的前期研究結(jié)果表明熊果酸在體外可以較明顯的抑制HSC細胞的增殖、誘導HSC細胞的凋亡,當熊果酸濃度小于75μM時對L02肝細胞的生長抑制率為負值,將熊果酸作用于二甲基亞硝胺(DMN)誘導的肝纖維化實驗大鼠后,能夠明顯改善肝纖維化大鼠肝功能,明顯減輕肝細胞壞死和降低肝臟組織膠原纖維增生程度,同時其能阻斷大鼠肝纖維化形成過程中肝臟氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。本研究將在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上觀察HSC內(nèi)活性氧參與調(diào)控肝星狀細胞凋亡的途徑,進一步探討熊果酸誘導其凋亡的可能作用機制,從而為肝纖維化治療提供新的治療方案。 目的:通過觀察HSC-T6在瘦素、熊果酸、NAC等藥物作用后,HSC-T6內(nèi)ROS水平、NF-κB活性、XIAPmRNA表達及凋亡率的變化,來探討HSC-T6內(nèi)活性氧參與調(diào)控肝星狀細胞凋亡的途徑及熊果酸誘導其凋亡的可能作用機制。 方法:取對數(shù)生長期的肝星狀細胞(HSC-T6)進行隨機分組:瘦素刺激組(100 ng/ml),熊果酸(50μM)預處理組,NAC(10mM)預處理組和空白對照組。熊果酸及NAC預處理組,分別用熊果酸、NAC預處理HSC30min后加入瘦素刺激。藥物作用HSC1h,12h,24h,采用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)DCF的熒光強度以觀察HSC內(nèi)ROS的水平;藥物作用2h后采用免疫細胞化學術(shù)檢測HCS-T6中NF-κB(P65)核移位率;12h、24h后RT-PCR方法檢測XIAP mRNA的表達;48h采用流式細胞術(shù)HSC-T6凋亡率的變化。 結(jié)果:1.瘦素刺激組細胞內(nèi)DCF熒光強度較空白對照組顯著增高(P0.001);瘦素刺激組HSC-T6細胞24h時細胞內(nèi)DCF熒光強度要高于作用12h時(P0.05);熊果酸預處理組、NAC預處理組細胞內(nèi)DCF熒光強度均低于同時間點瘦素刺激組(P0.001);熊果酸預處理組1、12、24小時細胞內(nèi)DCF熒光強度逐漸降低。 2.免疫細胞化學分析發(fā)現(xiàn),瘦素刺激組中將瘦素作用于HSC-T6細胞2小時后NF-κB出現(xiàn)明顯核移位現(xiàn)象,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.001);用熊果酸、NAC預處理HSC-T6細胞半小時后,再用瘦素刺激,發(fā)現(xiàn)前兩者NF-κB核移位率均顯著低于瘦素刺激組(P0.001),而它們兩者間NF-κB核移位率比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.瘦素刺激組中HSC-T6經(jīng)瘦素刺激后其XIAP mRNA表達在24h時顯著高于空白對照組(P0.01);HSC-T6經(jīng)過熊果酸、NAC預處理后XIAP mRNA的表達在12h均低于瘦素刺激組與空白對照組(P0.01~0.05),而兩預處理組XIAP mRNA的表達在12h差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);熊果酸預處理組XIAP mRNA的表達在24h要低于瘦素刺激組、空白對照組與NAC預處理組(P0.01);不同時間點:空白對照組、NAC預處理組XIAP mRNA的表達在12h、24h無顯著差異(P0.05);瘦素組XIAP mRNA的表達在24h時要高于12h(P0.01);熊果酸預處理組XIAP mRNA的表達在24h低于12h(P0.05)。 4.瘦素刺激組中HSC-T6細胞經(jīng)瘦素刺激48h后其凋亡率低于空白對照組(P0.05);熊果酸預處理組、NAC預處理組HSC-T6 48h凋亡率較瘦素組均有升高(P0.001、0.05),而熊果酸預處理組HSC-T6 48h凋亡率高于NAC預處組與空白對照組(P0.05)。 結(jié)論: 1.瘦素可以抑制HSC-T6細胞的凋亡,而HSC-T6細胞經(jīng)熊果酸預處理后,凋亡率升高,表明熊果酸可誘導HSC凋亡。 2.瘦素刺激HSC-T6后可使細胞內(nèi)ROS水平升高,而HSC-T6細胞經(jīng)熊果酸預處理后,其內(nèi)ROS水平降低,表明熊果酸可抑制由瘦素刺激導致的HSC-T6細胞內(nèi)ROS水平的升高。 3.瘦素可以促進HSC-T6細胞內(nèi)NF-κB活化及XIAPmRNA表達,而HSC-T6細胞經(jīng)熊果酸預處理后,NF-κB活性及XIAPmRNA表達明顯減弱,表明熊果酸可以抑制由瘦素刺激導致的細胞內(nèi)NF-κB活化及XIAPmRNA表達。 4.推測減少HSC-T6細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生、抑制NF-κB活化及XIAPmRNA的表達可能是熊果酸誘導HSC-T6細胞凋亡的機制之一。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

附圖 1：1h 時流式細胞儀檢查的 HSC-T6 細胞內(nèi) DCF 熒光強度結(jié)果A:瘦素組 D：空白對照組Marker % GatedAll 100.00M1 51.26M1CMarker % All 1M1 M1AMarker % GatedAll 100.00M1 95.04M1

附錄附圖 1：1h 時流式細胞儀檢查的 HSC-T6 細胞內(nèi) DCF 熒光強度結(jié)果A:瘦素組 D：空白對照組AMarker % GatedAll 100.00M1 95.04M1MaM1

各組藥物作用12h后流式細胞儀檢查的HSC-T6細胞內(nèi)DCF熒光強度結(jié)果

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李博;何文華;劉戈云;朱萱;;活性氧簇與肝纖維化發(fā)病的研究進展[J];國際消化病雜志;2009年02期

2 戴穎;朱萱;;熊果酸抗實驗性大鼠肝纖維化作用機制的研究[J];江西醫(yī)藥;2008年05期

本文編號：2818290