研究背景:肝纖維化是肝硬化的前期病理階段,是肝臟受到慢性損傷時(shí),細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)可逆性沉積的創(chuàng)傷愈合過程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纖維化形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是肝纖維化時(shí)ECM的主要來源細(xì)胞,因此促進(jìn)活化HSC的凋亡成為阻斷肝纖維化的重要策略。我們的前期研究結(jié)果表明熊果酸在體外可以較明顯的抑制HSC細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)HSC細(xì)胞的凋亡,當(dāng)熊果酸濃度小于75μM時(shí)對(duì)L02肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為負(fù)值,將熊果酸作用于二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠后,能夠明顯改善肝纖維化大鼠肝功能,明顯減輕肝細(xì)胞壞死和降低肝臟組織膠原纖維增生程度,同時(shí)其能阻斷大鼠肝纖維化形成過程中肝臟氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。本研究將在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上觀察HSC內(nèi)活性氧參與調(diào)控肝星狀細(xì)胞凋亡的途徑,進(jìn)一步探討熊果酸誘導(dǎo)其凋亡的可能作用機(jī)制,從而為肝纖維化治療提供新的治療方案。 目的:通過觀察HSC-T6在瘦素、熊果酸、NAC等藥物作用后,HSC-T6內(nèi)ROS水平、NF-κB活性、XIAPmRNA表達(dá)及凋亡率的變化,來探討HSC-T6內(nèi)活性氧參與調(diào)控肝星狀細(xì)胞凋亡的途徑及熊果酸誘導(dǎo)其凋亡的可能作用機(jī)制。 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)進(jìn)行隨機(jī)分組:瘦素刺激組(100 ng/ml),熊果酸(50μM)預(yù)處理組,NAC(10mM)預(yù)處理組和空白對(duì)照組。熊果酸及NAC預(yù)處理組,分別用熊果酸、NAC預(yù)處理HSC30min后加入瘦素刺激。藥物作用HSC1h,12h,24h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度以觀察HSC內(nèi)ROS的水平;藥物作用2h后采用免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)檢測(cè)HCS-T6中NF-κB(P65)核移位率;12h、24h后RT-PCR方法檢測(cè)XIAP mRNA的表達(dá);48h采用流式細(xì)胞術(shù)HSC-T6凋亡率的變化。 結(jié)果:1.瘦素刺激組細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度較空白對(duì)照組顯著增高(P0.001);瘦素刺激組HSC-T6細(xì)胞24h時(shí)細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度要高于作用12h時(shí)(P0.05);熊果酸預(yù)處理組、NAC預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度均低于同時(shí)間點(diǎn)瘦素刺激組(P0.001);熊果酸預(yù)處理組1、12、24小時(shí)細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度逐漸降低。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)分析發(fā)現(xiàn),瘦素刺激組中將瘦素作用于HSC-T6細(xì)胞2小時(shí)后NF-κB出現(xiàn)明顯核移位現(xiàn)象,與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);用熊果酸、NAC預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞半小時(shí)后,再用瘦素刺激,發(fā)現(xiàn)前兩者NF-κB核移位率均顯著低于瘦素刺激組(P0.001),而它們兩者間NF-κB核移位率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.瘦素刺激組中HSC-T6經(jīng)瘦素刺激后其XIAP mRNA表達(dá)在24h時(shí)顯著高于空白對(duì)照組(P0.01);HSC-T6經(jīng)過熊果酸、NAC預(yù)處理后XIAP mRNA的表達(dá)在12h均低于瘦素刺激組與空白對(duì)照組(P0.01~0.05),而兩預(yù)處理組XIAP mRNA的表達(dá)在12h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);熊果酸預(yù)處理組XIAP mRNA的表達(dá)在24h要低于瘦素刺激組、空白對(duì)照組與NAC預(yù)處理組(P0.01);不同時(shí)間點(diǎn):空白對(duì)照組、NAC預(yù)處理組XIAP mRNA的表達(dá)在12h、24h無顯著差異(P0.05);瘦素組XIAP mRNA的表達(dá)在24h時(shí)要高于12h(P0.01);熊果酸預(yù)處理組XIAP mRNA的表達(dá)在24h低于12h(P0.05)。 4.瘦素刺激組中HSC-T6細(xì)胞經(jīng)瘦素刺激48h后其凋亡率低于空白對(duì)照組(P0.05);熊果酸預(yù)處理組、NAC預(yù)處理組HSC-T6 48h凋亡率較瘦素組均有升高(P0.001、0.05),而熊果酸預(yù)處理組HSC-T6 48h凋亡率高于NAC預(yù)處組與空白對(duì)照組(P0.05)。 結(jié)論: 1.瘦素可以抑制HSC-T6細(xì)胞的凋亡,而HSC-T6細(xì)胞經(jīng)熊果酸預(yù)處理后,凋亡率升高,表明熊果酸可誘導(dǎo)HSC凋亡。 2.瘦素刺激HSC-T6后可使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,而HSC-T6細(xì)胞經(jīng)熊果酸預(yù)處理后,其內(nèi)ROS水平降低,表明熊果酸可抑制由瘦素刺激導(dǎo)致的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高。 3.瘦素可以促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化及XIAPmRNA表達(dá),而HSC-T6細(xì)胞經(jīng)熊果酸預(yù)處理后,NF-κB活性及XIAPmRNA表達(dá)明顯減弱,表明熊果酸可以抑制由瘦素刺激導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化及XIAPmRNA表達(dá)。 4.推測(cè)減少HSC-T6細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生、抑制NF-κB活化及XIAPmRNA的表達(dá)可能是熊果酸誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

附圖 1：1h 時(shí)流式細(xì)胞儀檢查的 HSC-T6 細(xì)胞內(nèi) DCF 熒光強(qiáng)度結(jié)果A:瘦素組 D：空白對(duì)照組Marker % GatedAll 100.00M1 51.26M1CMarker % All 1M1 M1AMarker % GatedAll 100.00M1 95.04M1

附錄附圖 1：1h 時(shí)流式細(xì)胞儀檢查的 HSC-T6 細(xì)胞內(nèi) DCF 熒光強(qiáng)度結(jié)果A:瘦素組 D：空白對(duì)照組AMarker % GatedAll 100.00M1 95.04M1MaM1

各組藥物作用12h后流式細(xì)胞儀檢查的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李博;何文華;劉戈云;朱萱;;活性氧簇與肝纖維化發(fā)病的研究進(jìn)展[J];國(guó)際消化病雜志;2009年02期

2 戴穎;朱萱;;熊果酸抗實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化作用機(jī)制的研究[J];江西醫(yī)藥;2008年05期

本文編號(hào)：2818290