背景:炎癥性腸病(inflammation bowel disease,IBD)是一種慢性非特異性腸道炎性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD)兩種。近年來隨著生活條件的改善和環(huán)境不斷變化,該病在我國的患病人數(shù)呈明顯增加趨勢。炎癥性腸病的病因和發(fā)病機制尚不明確,目前多認為該病的發(fā)生是由遺傳、環(huán)境、微生物和免疫等多種因素相互作用所致。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是真核細胞內(nèi)負責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊和分泌的重要細胞器,許多因素可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)紊亂,如營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激等,導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔堆積,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress,ERS)。當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,機體將啟動一系列適應(yīng)性反應(yīng)使細胞適應(yīng)應(yīng)激繼續(xù)存活,這種反應(yīng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)。未折疊蛋白反應(yīng)通過三種感受器蛋白發(fā)出一系列調(diào)節(jié)信號,通過限制蛋白質(zhì)翻譯減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷,幫助蛋白質(zhì)正確折疊,加速錯誤折疊蛋白質(zhì)降解,恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)時間過長或反應(yīng)程度過深將會引起細胞凋亡,導(dǎo)致組織細胞受損。腸道上皮細胞不斷更新,屬于高分泌細胞,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激尤其敏感。近年來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與多種疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān),由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)多條通路與炎癥反應(yīng)通路相偶聯(lián)。有人提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與炎癥性腸病的發(fā)生與發(fā)展,但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對炎癥性腸病的具體作用機制尚不明確。腸粘膜屏障損傷是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的一個關(guān)鍵因素,大量黏蛋白構(gòu)成的粘液層是腸粘膜重要的化學(xué)屏障,杯狀細胞產(chǎn)生的黏蛋白(mucin,MUC)2是結(jié)腸粘液層主要的大分子結(jié)構(gòu),有研究表明MUC2表達異常與腸道疾病密切相關(guān)。本研究利用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium,DSS)制造小鼠結(jié)腸炎模型,檢測炎癥狀態(tài)下結(jié)腸組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白和MUC2的表達情況,試圖為進一步認識炎癥性腸病的發(fā)病機制提供更多科學(xué)依據(jù)。目的:觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、PERK、ATF6、IRE1βm RNA和蛋白,IRE1α、CHOP、XBP1u和XBP1s m RNA以及MUC2 m RNA和蛋白在不同濃度DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組織中的表達情況,探討這些分子表達變化在炎癥過程中的意義。方法:將8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為三組:正常對照組:正常自由飲水;1.5%DSS組和2.5%DSS組:分別自由飲用含1.5%(1.5g/100ml)和2.5%DSS的水溶液6天建立急性腸炎模型。每組10只。通過疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分、測量結(jié)腸長度、蘇木素伊紅(hematoxylin andeosin,HE)染色病理評分、檢測炎性因子TNFα和IL-6 m RNA的表達水平來評估結(jié)腸炎癥損傷程度。采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色法檢測結(jié)腸組織中GRP78、IRE1β、ATF6、PERK和MUC2的蛋白表達水平;實時定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR)法檢測GRP78、IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6、XBP1u、XBP1s、CHOP和MUC2的m RNA表達水平。結(jié)果:1.正常對照組無結(jié)腸炎表現(xiàn),1.5%DSS組和2.5%DSS組分別呈輕度和重度結(jié)腸炎。炎性細胞因子TNFα和IL-6 m RNA在1.5%DSS組表達增加,在2.5%DSS組表達進一步增加(均P0.05)。2.免疫組化結(jié)果:GRP78、IRE1β、PERK、ATF6和MUC2蛋白在正常對照組均表達;IRE1β、PERK、ATF6和MUC2蛋白在1.5%DSS組表達減少(均P0.05);GRP78、IRE1β、PERK、ATF6和MUC2蛋白在2.5%DSS組表達均明顯減少(均P0.05);IRE1β、PERK、ATF6和MUC2在2.5%DSS組與1.5%DSS組表達差別不明顯。3.RT-PCR結(jié)果:GRP78、IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6、XBP1u、XBP1s、CHOP和MUC2 m RNA在正常對照組均表達;GRP78、CHOP m RNA在1.5%DSS組無變化,2.5%DSS組明顯減少(均P0.05);XBP1u m RNA三組之間無差異;IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6和MUC2 m RNA在1.5%DSS組和2.5%DSS組表達均減少(均P0.05),2.5%DSS組與1.5%DSS組之間無差別。結(jié)論:1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6、CHOP、XBP1u及XBP1s在結(jié)腸正常結(jié)構(gòu)及生理功能的維持中發(fā)揮作用2.炎癥狀態(tài)下GRP78、IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6、CHOP和XBP1s表達均減少,這種減少導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)能力的下降在炎癥過程中可能起到一定作用。3.MUC2表達減少導(dǎo)致的腸粘膜屏障損傷與腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
【學(xué)位單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R574.62
【部分圖文】：

第 3 章 結(jié)果第 3 章 結(jié)果 小鼠急性結(jié)腸炎造模結(jié)果.1 一般情況觀察及 DAI 評分正常對照組小鼠造模期間進食飲水、精神狀態(tài)、活動、大小便均正常，澤，體重逐日遞增。1.5%DSS 組小鼠于造模第 5 天出現(xiàn)懶動、進食飲水7 天 5 只小鼠出現(xiàn)肉眼血便，并伴有稀便和肛周潮濕，同時出現(xiàn)體重下%DSS 組小鼠于造模第 4 天開始相繼出現(xiàn)懶動、精神萎靡、毛發(fā)黯淡無光水減少，并出現(xiàn)稀便、肉眼血便、肛周潮濕現(xiàn)象，第 7 天 9 只小鼠肉眼，4 只體重下降超過 10%，但無小鼠死亡。1.5%DSS 組和 2.5%DSS 組和 DAI 評分與正常對照組相比均顯著增高 (均 P<0.05) (圖 3-1 和圖 3-

圖 3-2 各組小鼠疾病活動指數(shù) (DAI) 評分 (n=10/組)附注：a: P<0.05 vs 正常對照組；c: P<0.05 vs 1.5%DSS 組ig. 3-2 The scores of disease activity index of mice with different treatments (n=10/groNote: a: P<0.05 vs normal control; c: P<0.05 vs 1.5%DSS group2 結(jié)腸外觀及長度測量正常對照組小鼠結(jié)腸腸壁光滑，腸腔內(nèi)充滿橢圓形糞便。1.5%DSS DSS 組小鼠結(jié)腸內(nèi)均含不成形稀便及不同程度血便，結(jié)腸腸壁與對照組變薄。1.5%DSS 組和 2.5%DSS 組小鼠結(jié)腸長度均較正常對照組明顯P<0.05)，2.5%DSS 組與 1.5%DSS 組相比縮短更加明顯 (P<0.05) (表 3表 3-1 各組小鼠結(jié)腸長度Tab. 3-1 The colon length of mice with different treatments分組 例數(shù) 結(jié)腸長度 (cm)

表 3-2 各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)評分Tab. 3-2 The scores of histological index of mouse colon tissues分組 例數(shù) 組織學(xué)評分正常對照組 10 0.5±0.81.5%DSS 組 10 6±1.4a2.5%DSS 組 10 8.3±1.5ac附注：a: P<0.05 vs 正常對照組；c: P<0.05 vs 1.5%DSS 組Note: a: P<0.05 vs normal control; c: P<0.05 vs 1.5%DSS group4 炎性指標(biāo) TNFα、IL-6 mRNA 檢測結(jié)果1.5%DSS 組和 2.5%DSS 組 TNFα mRNA 均較正常對照組明顯升高.05)；與正常對照組相比，IL-6 mRNA 在 1.5%DSS 組和 2.5%DSS 組均 (均 P<0.05) (圖 3-3)。

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本文編號：2818327