研究背景與目的 肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)的病理改變。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellate cell, HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，也是膠原蛋白沉積的關(guān)鍵因素。microRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究表明microRNA是慢性肝臟疾病進(jìn)展過程中的重要調(diào)節(jié)因子。已有大量國(guó)內(nèi)外文章報(bào)道m(xù)iR-214在多種細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、脂肪代謝等。既往芯片數(shù)據(jù)顯示miR-214在大鼠肝星狀細(xì)胞活化過程中顯著升高，本論文研究目的旨在研究miR-214在肝星狀細(xì)胞活化過程中的調(diào)節(jié)作用，為肝纖維化的早期干預(yù)提供新的思路。 本研究通過應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)肝星狀細(xì)胞活化過程(靜息狀態(tài)—活化狀態(tài))、DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0—S4期)、乙肝（HBV）相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織(F0—F4期)以及TGF-β刺激前后的肝星狀細(xì)胞進(jìn)行miR-214表達(dá)水平檢測(cè)，證實(shí)miR-214在肝星狀細(xì)胞活化過程、DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型、HBV相關(guān)肝纖維化病人肝組織標(biāo)本以及TGF-β刺激后的肝星狀細(xì)胞中顯著升高，并與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。通過構(gòu)建miR-214過表達(dá)及knockdown慢病毒載體，研究miR-214對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和活化功能的影響，并探討可能的機(jī)制。研究共分三個(gè)部分：（1）肝星狀細(xì)胞活化過程、DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織、乙型病毒肝炎（HBV）相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織以及TGF-β刺激前后的肝星狀細(xì)胞進(jìn)行miR-214表達(dá)水平檢測(cè)；（2）miR-214慢病毒載體（過表達(dá)及knockdown）對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、遷移與活化功能的影響；（3）miR-214靶基因的驗(yàn)證。 一、miR-214與肝星狀細(xì)胞的活化密切相關(guān) 目的：檢測(cè)miR-214在不同狀態(tài)肝星狀細(xì)胞以及各期肝纖維化組織中的表達(dá)水平，了解miR-214與肝星狀細(xì)胞活化以及肝纖維化進(jìn)程的相關(guān)性。 方法：分離培養(yǎng)原代肝星狀細(xì)胞，收集24例不同分期的肝纖維化病人肝穿標(biāo)本，并構(gòu)建DMN誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型，通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)肝星狀細(xì)胞活化過程、DMN模型肝纖維化S0—S4期、乙肝相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織(F0—F4期)以及TGF-β刺激前后的肝星狀細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平。 結(jié)果：成功分離、鑒定、培養(yǎng)原代肝星狀細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及活化標(biāo)志物的表達(dá)，將HSC2d作為靜息狀態(tài)HSC，14d作為完全活化狀態(tài)HSC；構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，根據(jù)肝組織病理結(jié)果，DMN給藥第一到第四周分別對(duì)應(yīng)肝纖維化S1-S4期。抽提細(xì)胞、組織RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法證實(shí)：miR-214在肝星狀細(xì)胞活化過程、DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型、HBV相關(guān)肝纖維化病人肝組織標(biāo)本以及TGF-β刺激后的肝星狀細(xì)胞中顯著升高，并與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。miR-214在HSC活化過程中表達(dá)顯著升高達(dá)26倍(P0.01);以S0期肝組織作為對(duì)照組，S1-S4期組織中miR-214水平分別為對(duì)照組1.8倍、2.2倍、4倍、7.8倍(P0.05);以F0期肝組織作為對(duì)照組，F(xiàn)1-F4期組織中miR-214水平分別為對(duì)照組5倍、9倍、6倍、7倍(P0.01); TGF-β刺激后miR-214表達(dá)明顯升高達(dá)刺激前7倍(P0.05). 二、 miR-214促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的遷移與活化 目的：研究miR-214在細(xì)胞分子水平對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、遷移和活化功能的影響。 方法：構(gòu)建miR-214過表達(dá)及knockdown慢病毒；以不同MOI值(MOI取10到30)感染HSC-T6，應(yīng)用熒光顯微鏡及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)評(píng)估其感染效率；應(yīng)用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞遷移，real-time PCR、Western Blot方法檢測(cè)肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志物Type I collagen與α-SMA mRNA與蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)果：成功構(gòu)建miR-214過表達(dá)及knockdown慢病毒載體，MOI值=30時(shí)，慢病毒感染HSC-T6的效率達(dá)90%以上，real-time PCR檢測(cè)miR-214過表達(dá)慢病毒感染HSC-T6后miR-214的表達(dá)量增加3倍(P0.01)；與陰性病毒感染組（mock）相比，miR-214能顯著促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的遷移與活化，但是對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。 三、miR-214靶基因的驗(yàn)證 目的：探索miR-214在肝星狀細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)作用的可能機(jī)制。 方法：采用生物信息學(xué)技術(shù)篩選相關(guān)靶基因，通過熒光質(zhì)粒報(bào)告系統(tǒng)對(duì)靶基因HIF1AN進(jìn)行驗(yàn)證；采用實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot檢測(cè)miR-214過表達(dá)及knockdown組、肝星狀細(xì)胞活化過程（靜息狀態(tài)-活化狀態(tài)）中、TGF-β刺激前后以及乙型病毒肝炎（HBV）相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織中HIF1AN的表達(dá)。 結(jié)果：熒光質(zhì)粒報(bào)告系統(tǒng)顯示：miR-214可以顯著抑制攜有HIF1AN3’UTR的載體的熒光素酶活性達(dá)40%(P0.001)；與陰性病毒感染組相比，miR-214過表達(dá)顯著降低HIF1AN mRNA和蛋白的表達(dá)量(P0.01)，miR-214knockdown顯著增加HIF1ANmRNA和蛋白的表達(dá)量(P0.05)；與靜息狀態(tài)（2d）肝星狀細(xì)胞相比，HIF1AN在活化狀態(tài)（14d）肝星狀細(xì)胞中表達(dá)下降50%(P0.001)；與TGF-β刺激前相比，TGF-β刺激后HIF1AN表達(dá)量下降35%(P0.01)；與F0期病人肝組織相比，HIF1AN表達(dá)量與肝纖維化程度呈反比(P0.05)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)由SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)包處理。多組間的比較用One-Way ANOVA方差分析。P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論 一、miR-214在肝星狀細(xì)胞活化過程、DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型、HBV相關(guān)肝纖維化病人肝組織標(biāo)本以及TGF-β刺激后的肝星狀細(xì)胞中顯著升高，并與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。 二、肝星狀細(xì)胞中miR-214顯著促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化、遷移，但是對(duì)增殖并無影響。 三、細(xì)胞、組織水平證實(shí)HIF1AN表達(dá)水平與miR-214呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)而推測(cè)miR-214對(duì)肝星狀細(xì)胞生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)可能是通過下調(diào)HIF1AN的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

QRT-PCR檢測(cè)肝纖維化模型各期肝組織中mi注：與S0期肝組織相比，*P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)V 相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織中 m,4)共24例HBV相關(guān)肝纖維化病人的肝穿標(biāo)本HBV感染但無肝纖維化的病人標(biāo)本作為對(duì)照組PCR技術(shù)進(jìn)行miR-214水平的檢測(cè)，應(yīng)用PCmiR-214的表達(dá)。結(jié)果顯示：miR-214在肝纖維織作為對(duì)照組，F(xiàn)1-F4期組織中miR-214水平分01)。

PCR檢測(cè)HBV相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織中miR注：與F0期肝組織相比，**P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意F-β刺激前后 HSC-T6 中 miR-214 的差l)加入大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)并孵育24h后抽提肝星狀細(xì)胞miR-214水平的檢測(cè)，應(yīng)用real-time PC肝星狀細(xì)胞中miR-214表達(dá)。結(jié)果顯示：TGF-β刺激7倍(P<0.05)。

R檢測(cè)HBV相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織中注：與F0期肝組織相比，**P<0.01，差異有統(tǒng)-β刺激前后 HSC-T6 中 miR-214入大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)并孵育24h后星狀細(xì)胞miR-214水平的檢測(cè)，應(yīng)用real-tim星狀細(xì)胞中miR-214表達(dá)。結(jié)果顯示：TGF(P<0.05)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 喬俏;周泓旭;李光;;HIF-1α對(duì)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的探討[J];中華腫瘤防治雜志;2011年07期

本文編號(hào)：2817313