背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床上常見急腹癥之一。輕癥急性胰腺炎(mildpancreatitis,MP)預后較好,臨床上約有20%病例會發(fā)展到重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),病情兇險,早期就會發(fā)生急性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response sysdrome,SIRS),進一步還會發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction sysdrome,MODS)。盡管診斷方法和治療手段不斷改進,死亡率仍然高達20%以上。更重要的是,從輕癥發(fā)展到重癥的啟動機制尚未完全明確。中醫(yī)研究認為“通里攻下”在控制SAP早期發(fā)展過程中起到非常重要的作用。傳統(tǒng)中藥大黃有多種活性成分和廣泛的藥理作用,其“通下”、消炎和改善血液循環(huán)的功能在重癥急性胰腺炎治療中發(fā)揮重要作用,但具體作用機制尚未明確。大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌,Emodin)是一種由大黃提取純化而來的蒽醌類化合物,可作為有效單體參與大黃對胃腸道粘膜保護機制的研究。已有研究表明急性胰腺炎早期炎癥因素可以促發(fā)腸粘膜屏障的損害,隨后引發(fā)的腸道細菌內(nèi)毒素釋放入血液循環(huán),可促發(fā)炎癥因子(如IL-1β、IL-18等)爆發(fā)式釋放,會引起腸道及全身多臟器的損傷和功能衰竭,而這正是重癥急性胰腺炎高致死性和致殘率的原因。有研究表明作為IL-1β活性轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1 beta-converting enzyme,ICE)的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteiny1 aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)在重癥急性胰腺炎的炎癥因子激活和爆發(fā)過程中起到一個關(guān)鍵的樞紐作用,研究caspase-1參與重癥急性胰腺炎反應的具體途徑,以及大黃素是否通過抑制caspase-1的表達,影響caspase-1相關(guān)炎癥信號通路的炎癥因子和炎癥介質(zhì)的釋放,達到修復受損腸粘膜屏障的功效,減少細菌和內(nèi)毒素通過腸粘膜屏障進入血液循環(huán)產(chǎn)生“二次打擊”,進而起到治療重癥急性胰腺炎的功效。相關(guān)研究成果會對明確大黃素治療重癥急性胰腺炎的作用機制有所幫助。目的:本研究以caspase-1信號通路為研究途徑,通過SAP動物模型為實驗載體,以大黃素和caspase-1拮抗劑作為兩個干預因素,研究Caspase-1信號通路在SAP大鼠腸黏膜屏障損傷過程中所起到的促進作用;研究Caspase-1抑制劑和大黃素對Caspase-1蛋白的表達及對其引發(fā)的炎癥信號通路的抑制作用,對比療效判斷大黃素和Caspase-1抑制劑對腸道黏膜保護作用的靶點和機制是否一致,判斷大黃素對腸粘膜的保護作用是否通過抑制Caspase-1蛋白表達來實現(xiàn)的,探索其分子機制,尋找新的治療靶點,以期對SAP的精準治療方案提供新的思路和途徑。方法:80只SD大鼠被隨機分成四組(每組20只):空白對照組(sham-operated group,SO)、重癥急性胰腺炎組(severe acute pancreatitis group,SAP)、大黃素預處理組(emodin-treated group,EM)、caspase-1 抑制劑預處理組(ICE-I)。SAP 大鼠模型是通過3.5%的牛磺膽酸鈉從十二指腸胰膽管入口處逆行灌入造模成功。作為干預劑的大黃素和caspase-1抑制劑分別在SAP造模前30分鐘預先給藥。在造模后24小時處死大鼠后取材檢驗:通過Elisa法測定各分組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量差異;通過改良鱟試劑凝膠基質(zhì)顯色法檢測各組實驗大鼠血清內(nèi)毒素含量的差異;光學顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察胰腺和小腸粘膜病理結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)線粒體等細胞器超微結(jié)構(gòu)的改變;原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)檢測各組大鼠末端回腸粘膜凋亡細胞的數(shù)量;并通過熒光定量PCR、western blot和免疫組化法等方法測定各實驗組大鼠腸粘膜中caspase-1的mRNA和蛋白表達差異。結(jié)果:造模后24小時內(nèi),單純SAP造模組中8只大鼠死亡(生存率60%),大黃干預組有2只大鼠死亡(生存率90%),ICE-I干預組內(nèi)3只大鼠死亡(生存率85%),而假手術(shù)組無大鼠死亡(生存率100%)。造模成功后24小時,發(fā)現(xiàn)SAP組大鼠相對于SO組大鼠,可以檢測出明顯升高的血清IL-1β和IL-18水平,光學顯微鏡下顯示胰腺和腸粘膜組織炎癥細胞浸潤,出血、壞死程度明顯加重,組織學評分明顯增高,有統(tǒng)計學意義(p0.05),透射電鏡下SAP大鼠腸粘膜細胞間隙模糊,細胞間連接消失,細胞內(nèi)包括線粒體在內(nèi)的細胞器腫脹。caspase-1的mRNA和蛋白表達水平較SO組明顯升高,有統(tǒng)計學意義(P0.05),末端回腸粘膜組織粘膜層及固有層細胞凋亡明顯增多,呈凋亡過度狀況。而相對于SAP組大鼠,通過造模前caspase-1抑制劑和大黃素干預的大鼠實驗組(ICE-I組和EM組),無論從血清IL-1β、IL-18含量,胰腺和腸粘膜組織病理學評分,還是腸粘膜組織中caspase-1的mRNA和蛋白表達水平都明顯降低,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。末端回腸粘膜細胞凋亡明顯減少,透射電鏡下回腸粘膜細胞間的細胞連接和胞內(nèi)細胞器腫脹損害程度明顯減輕。ICE-I組和EM組相比較,以上觀察和檢測指標對比差異不大,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:等同于caspase-1抑制劑,大黃素通過抑制腸粘膜細胞caspase-1的蛋白表達,并進一步抑制其炎癥信號通道下游的包括IL-1β和IL-18在內(nèi)的眾多炎癥因子和炎癥介質(zhì)的激活和釋放,能明顯減輕胰腺炎的嚴重程度和對腸粘膜屏障造成的繼發(fā)性損害,減輕由此引發(fā)的腸內(nèi)細菌和內(nèi)毒素易位入血對急性胰腺炎大鼠造成的“二次打擊”。在一定程度上減輕了急性胰腺炎合并周身多臟器功能衰竭的危重程度和發(fā)病范圍,為重癥急性胰腺炎精準治療尋找新的治療靶點和路徑做了有益的探索。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R576
【部分圖文】：

．組的生存率無明顯差異。逡逑造模成功２４小時后處死大鼠，逐層開腹：假手術(shù)組（ＳＯ組）未見到腹水、逡逑胰腺壞死、皂化及胃腸道脹氣（見附圖２）。單純ＳＡＰ組大鼠可見腹腔大量淡紅逡逑色或淡黃色，呈惡臭味道的腹水存在，胃腸道呈明顯脹氣狀態(tài)，在胃后胰腺區(qū)可逡逑見胰腺腫脹，大片狀出血壞死，部分區(qū)域胰腺表面及周圍系膜區(qū)可見有積膿和皂逡逑化斑等存在，而ＥＭ組和ＩＣＥ－Ｉ組可見有少量淡紅色，輕度臭味的腹水存在，胃逡逑腸脹氣較ＳＡＰ組減輕（見附圖３，邋４）。逡逑３．２胰腺及末端回腸組織病理切片ＨＥ染色及病理學評分逡逑各組大鼠胰腺的組織病理學結(jié)果顯示，ＳＯ組的大鼠胰腺結(jié)構(gòu)無明顯病理改逡逑變。相比之下，ＳＡＰ造模組的大鼠胲腺則出現(xiàn)廣泛出血、壞死及炎癥細胞大量浸逡逑．邐潤，并伴有嚴重水腫，胰腺小葉明顯分離。ＥＭ組與ＩＣＥ－Ｉ組的組織病理學改變逡逑較ＳＡＰ造模組有明顯好轉(zhuǎn)

甚至脫落，并可見固有層、粘膜下層及漿膜層出現(xiàn)壞死，伴炎癥細胞逡逑彌漫浸潤。ＥＭ組與ＩＣＥ－Ｉ組的末端回腸組織損傷情況較ＳＡＰ造模組有明顯好轉(zhuǎn)，逡逑粘膜破損程度減輕，絨毛相對整齊，壞死灶減少，散在炎癥細胞浸潤（見圖１）。逡逑２６逡逑

見胰腺腫脹，大片狀出血壞死，部分區(qū)域胰腺表面及周圍系膜區(qū)可見有積膿和皂逡逑化斑等存在，而ＥＭ組和ＩＣＥ－Ｉ組可見有少量淡紅色，輕度臭味的腹水存在，胃逡逑腸脹氣較ＳＡＰ組減輕（見附圖３，邋４）。逡逑３．２胰腺及末端回腸組織病理切片ＨＥ染色及病理學評分逡逑各組大鼠胰腺的組織病理學結(jié)果顯示，ＳＯ組的大鼠胰腺結(jié)構(gòu)無明顯病理改逡逑變。相比之下，ＳＡＰ造模組的大鼠胲腺則出現(xiàn)廣泛出血、壞死及炎癥細胞大量浸逡逑．邐潤，并伴有嚴重水腫，胰腺小葉明顯分離。ＥＭ組與ＩＣＥ－Ｉ組的組織病理學改變逡逑較ＳＡＰ造模組有明顯好轉(zhuǎn)，出血、壞死程度減輕，局部有部分炎癥細胞浸潤，伴逡逑輕度水腫。逡逑末端回腸的組織病理學結(jié)果提示：ＳＯ組的大鼠回腸粘膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列逡逑整齊。ＳＡＰ模型組回腸粘膜出現(xiàn)明顯的病理改變，包括回腸粘膜結(jié)構(gòu)破損，絨毛逡逑排列紊亂，甚至脫落，并可見固有層、粘膜下層及漿膜層出現(xiàn)壞死，伴炎癥細胞逡逑彌漫浸潤。ＥＭ組與ＩＣＥ－Ｉ組的末端回腸組織損傷情況較ＳＡＰ造模組有明顯好轉(zhuǎn)

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本文編號：2817498