背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床上常見急腹癥之一。輕癥急性胰腺炎(mildpancreatitis,MP)預(yù)后較好,臨床上約有20%病例會(huì)發(fā)展到重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),病情兇險(xiǎn),早期就會(huì)發(fā)生急性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response sysdrome,SIRS),進(jìn)一步還會(huì)發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction sysdrome,MODS)。盡管診斷方法和治療手段不斷改進(jìn),死亡率仍然高達(dá)20%以上。更重要的是,從輕癥發(fā)展到重癥的啟動(dòng)機(jī)制尚未完全明確。中醫(yī)研究認(rèn)為“通里攻下”在控制SAP早期發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用。傳統(tǒng)中藥大黃有多種活性成分和廣泛的藥理作用,其“通下”、消炎和改善血液循環(huán)的功能在重癥急性胰腺炎治療中發(fā)揮重要作用,但具體作用機(jī)制尚未明確。大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌,Emodin)是一種由大黃提取純化而來(lái)的蒽醌類化合物,可作為有效單體參與大黃對(duì)胃腸道粘膜保護(hù)機(jī)制的研究。已有研究表明急性胰腺炎早期炎癥因素可以促發(fā)腸粘膜屏障的損害,隨后引發(fā)的腸道細(xì)菌內(nèi)毒素釋放入血液循環(huán),可促發(fā)炎癥因子(如IL-1β、IL-18等)爆發(fā)式釋放,會(huì)引起腸道及全身多臟器的損傷和功能衰竭,而這正是重癥急性胰腺炎高致死性和致殘率的原因。有研究表明作為IL-1β活性轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1 beta-converting enzyme,ICE)的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteiny1 aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)在重癥急性胰腺炎的炎癥因子激活和爆發(fā)過(guò)程中起到一個(gè)關(guān)鍵的樞紐作用,研究caspase-1參與重癥急性胰腺炎反應(yīng)的具體途徑,以及大黃素是否通過(guò)抑制caspase-1的表達(dá),影響caspase-1相關(guān)炎癥信號(hào)通路的炎癥因子和炎癥介質(zhì)的釋放,達(dá)到修復(fù)受損腸粘膜屏障的功效,減少細(xì)菌和內(nèi)毒素通過(guò)腸粘膜屏障進(jìn)入血液循環(huán)產(chǎn)生“二次打擊”,進(jìn)而起到治療重癥急性胰腺炎的功效。相關(guān)研究成果會(huì)對(duì)明確大黃素治療重癥急性胰腺炎的作用機(jī)制有所幫助。目的:本研究以caspase-1信號(hào)通路為研究途徑,通過(guò)SAP動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)載體,以大黃素和caspase-1拮抗劑作為兩個(gè)干預(yù)因素,研究Caspase-1信號(hào)通路在SAP大鼠腸黏膜屏障損傷過(guò)程中所起到的促進(jìn)作用;研究Caspase-1抑制劑和大黃素對(duì)Caspase-1蛋白的表達(dá)及對(duì)其引發(fā)的炎癥信號(hào)通路的抑制作用,對(duì)比療效判斷大黃素和Caspase-1抑制劑對(duì)腸道黏膜保護(hù)作用的靶點(diǎn)和機(jī)制是否一致,判斷大黃素對(duì)腸粘膜的保護(hù)作用是否通過(guò)抑制Caspase-1蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,探索其分子機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn),以期對(duì)SAP的精準(zhǔn)治療方案提供新的思路和途徑。方法:80只SD大鼠被隨機(jī)分成四組(每組20只):空白對(duì)照組(sham-operated group,SO)、重癥急性胰腺炎組(severe acute pancreatitis group,SAP)、大黃素預(yù)處理組(emodin-treated group,EM)、caspase-1 抑制劑預(yù)處理組(ICE-I)。SAP 大鼠模型是通過(guò)3.5%的�；悄懰徕c從十二指腸胰膽管入口處逆行灌入造模成功。作為干預(yù)劑的大黃素和caspase-1抑制劑分別在SAP造模前30分鐘預(yù)先給藥。在造模后24小時(shí)處死大鼠后取材檢驗(yàn):通過(guò)Elisa法測(cè)定各分組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量差異;通過(guò)改良鱟試劑凝膠基質(zhì)顯色法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清內(nèi)毒素含量的差異;光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察胰腺和小腸粘膜病理結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)線粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的改變;原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)各組大鼠末端回腸粘膜凋亡細(xì)胞的數(shù)量;并通過(guò)熒光定量PCR、western blot和免疫組化法等方法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠腸粘膜中caspase-1的mRNA和蛋白表達(dá)差異。結(jié)果:造模后24小時(shí)內(nèi),單純SAP造模組中8只大鼠死亡(生存率60%),大黃干預(yù)組有2只大鼠死亡(生存率90%),ICE-I干預(yù)組內(nèi)3只大鼠死亡(生存率85%),而假手術(shù)組無(wú)大鼠死亡(生存率100%)。造模成功后24小時(shí),發(fā)現(xiàn)SAP組大鼠相對(duì)于SO組大鼠,可以檢測(cè)出明顯升高的血清IL-1β和IL-18水平,光學(xué)顯微鏡下顯示胰腺和腸粘膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),出血、壞死程度明顯加重,組織學(xué)評(píng)分明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),透射電鏡下SAP大鼠腸粘膜細(xì)胞間隙模糊,細(xì)胞間連接消失,細(xì)胞內(nèi)包括線粒體在內(nèi)的細(xì)胞器腫脹。caspase-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平較SO組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),末端回腸粘膜組織粘膜層及固有層細(xì)胞凋亡明顯增多,呈凋亡過(guò)度狀況。而相對(duì)于SAP組大鼠,通過(guò)造模前caspase-1抑制劑和大黃素干預(yù)的大鼠實(shí)驗(yàn)組(ICE-I組和EM組),無(wú)論從血清IL-1β、IL-18含量,胰腺和腸粘膜組織病理學(xué)評(píng)分,還是腸粘膜組織中caspase-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平都明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。末端回腸粘膜細(xì)胞凋亡明顯減少,透射電鏡下回腸粘膜細(xì)胞間的細(xì)胞連接和胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹損害程度明顯減輕。ICE-I組和EM組相比較,以上觀察和檢測(cè)指標(biāo)對(duì)比差異不大,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:等同于caspase-1抑制劑,大黃素通過(guò)抑制腸粘膜細(xì)胞caspase-1的蛋白表達(dá),并進(jìn)一步抑制其炎癥信號(hào)通道下游的包括IL-1β和IL-18在內(nèi)的眾多炎癥因子和炎癥介質(zhì)的激活和釋放,能明顯減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度和對(duì)腸粘膜屏障造成的繼發(fā)性損害,減輕由此引發(fā)的腸內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素易位入血對(duì)急性胰腺炎大鼠造成的“二次打擊”。在一定程度上減輕了急性胰腺炎合并周身多臟器功能衰竭的危重程度和發(fā)病范圍,為重癥急性胰腺炎精準(zhǔn)治療尋找新的治療靶點(diǎn)和路徑做了有益的探索。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R576
【部分圖文】：

．組的生存率無(wú)明顯差異。逡逑造模成功２４小時(shí)后處死大鼠，逐層開腹：假手術(shù)組（ＳＯ組）未見到腹水、逡逑胰腺壞死、皂化及胃腸道脹氣（見附圖２）。單純ＳＡＰ組大鼠可見腹腔大量淡紅逡逑色或淡黃色，呈惡臭味道的腹水存在，胃腸道呈明顯脹氣狀態(tài)，在胃后胰腺區(qū)可逡逑見胰腺腫脹，大片狀出血壞死，部分區(qū)域胰腺表面及周圍系膜區(qū)可見有積膿和皂逡逑化斑等存在，而ＥＭ組和ＩＣＥ－Ｉ組可見有少量淡紅色，輕度臭味的腹水存在，胃逡逑腸脹氣較ＳＡＰ組減輕（見附圖３，邋４）。逡逑３．２胰腺及末端回腸組織病理切片ＨＥ染色及病理學(xué)評(píng)分逡逑各組大鼠胰腺的組織病理學(xué)結(jié)果顯示，ＳＯ組的大鼠胰腺結(jié)構(gòu)無(wú)明顯病理改逡逑變。相比之下，ＳＡＰ造模組的大鼠胲腺則出現(xiàn)廣泛出血、壞死及炎癥細(xì)胞大量浸逡逑．邐潤(rùn)，并伴有嚴(yán)重水腫，胰腺小葉明顯分離。ＥＭ組與ＩＣＥ－Ｉ組的組織病理學(xué)改變逡逑較ＳＡＰ造模組有明顯好轉(zhuǎn)

甚至脫落，并可見固有層、粘膜下層及漿膜層出現(xiàn)壞死，伴炎癥細(xì)胞逡逑彌漫浸潤(rùn)。ＥＭ組與ＩＣＥ－Ｉ組的末端回腸組織損傷情況較ＳＡＰ造模組有明顯好轉(zhuǎn)，逡逑粘膜破損程度減輕，絨毛相對(duì)整齊，壞死灶減少，散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖１）。逡逑２６逡逑

見胰腺腫脹，大片狀出血壞死，部分區(qū)域胰腺表面及周圍系膜區(qū)可見有積膿和皂逡逑化斑等存在，而ＥＭ組和ＩＣＥ－Ｉ組可見有少量淡紅色，輕度臭味的腹水存在，胃逡逑腸脹氣較ＳＡＰ組減輕（見附圖３，邋４）。逡逑３．２胰腺及末端回腸組織病理切片ＨＥ染色及病理學(xué)評(píng)分逡逑各組大鼠胰腺的組織病理學(xué)結(jié)果顯示，ＳＯ組的大鼠胰腺結(jié)構(gòu)無(wú)明顯病理改逡逑變。相比之下，ＳＡＰ造模組的大鼠胲腺則出現(xiàn)廣泛出血、壞死及炎癥細(xì)胞大量浸逡逑．邐潤(rùn)，并伴有嚴(yán)重水腫，胰腺小葉明顯分離。ＥＭ組與ＩＣＥ－Ｉ組的組織病理學(xué)改變逡逑較ＳＡＰ造模組有明顯好轉(zhuǎn)，出血、壞死程度減輕，局部有部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴逡逑輕度水腫。逡逑末端回腸的組織病理學(xué)結(jié)果提示：ＳＯ組的大鼠回腸粘膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列逡逑整齊。ＳＡＰ模型組回腸粘膜出現(xiàn)明顯的病理改變，包括回腸粘膜結(jié)構(gòu)破損，絨毛逡逑排列紊亂，甚至脫落，并可見固有層、粘膜下層及漿膜層出現(xiàn)壞死，伴炎癥細(xì)胞逡逑彌漫浸潤(rùn)。ＥＭ組與ＩＣＥ－Ｉ組的末端回腸組織損傷情況較ＳＡＰ造模組有明顯好轉(zhuǎn)

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本文編號(hào)：2817498