研究背景 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種以多見于女性的慢性自身免疫性肝臟疾病,其發(fā)病機制至今仍沒有完全闡明,PBC的血清標志物在PBC的診斷中具有無可替代的作用,但目前使用的PBC血清標志物并不理想,因此用新的研究手段進行PBC血清標志物的研究顯得非常重要。 研究方法 以人類cDNA文庫為模板,設計目的基因的特異引物,將PCR擴增的目的基因產(chǎn)物和線性化的酵母表達質(zhì)粒pEGH共轉染酵母Y258。利用半乳糖誘導含有目的基因的酵母克隆表達重組蛋白。通過谷胱甘肽親和層析柱純化含GST標簽目的重組蛋白點制高通量芯片。采用人類基因組編碼蛋白高通量芯片篩選原發(fā)性膽汁性肝硬化血清,尋找PBC特異性血清標志物。 研究結果 制備的高通量蛋白芯片共計38 400個蛋白點,含17 718個人類基因編碼蛋白,該芯片蛋白點的檢出率為97.6%,蛋白復點間檢測信號強度的相關系數(shù)為0.98。該芯片在PBC組與對照組間篩選出18個具有統(tǒng)計學意義(P0.01)標志物。在最好的5個標志物中,針對PDHA1、DBT和DLAT的抗體為現(xiàn)在已經(jīng)使用的PBC標志物AMA-M2組成部分,針對HKl和ZNF364的抗體為新發(fā)現(xiàn)的PBC標志物,在PBC中的陽性率分別為52.38%(11／21)和38.10%(8／21),在對照組中的陽性率均為0.00%(0／30)。AMA-M2陽性與AMA—M2陰性PBC患者間沒發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學意義的血清標志物。ACA陽性與ACA陰性PBC患者間僅針對CENPB的抗體具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 研究結論 人類基因組編碼蛋白高通量芯片是一種快速全面篩選PBC新標志物的技術。針對HKl和ZNF364的抗體具有較好的敏感性和特異性,可以作為PBC新標志物。AMA-M2陽性與AMA-M2陰性PBC患者間沒發(fā)現(xiàn)具有意義的血清標志物,所謂的AMA-M2陰性患者可能是由于檢測方法所致的假陰性。PBC患者的ACA以B亞型為主,而針對CENPB的抗體可以作為ACA陽性與ACA陰性PBC患者間的標志物。 研究目的 檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者血清抗釀酒酵母細胞抗體(ASCA),探討其在PBC中的陽性狀況以及與其他PBC自身抗體的關系和臨床意義。研究方法 采用ELISA檢測198例PBC患者、44例自身免疫性肝炎(AIH)患者、41例肝病對照組(LDC)患者、169例炎癥性腸病(IBD)患者及167例其他疾病對照組患者血清ASCA的IgA和IgG亞型,分析該抗體與各種指標的相互關系。 研究結果 ASCA-IgA在PBC患者中的陽性率為24.2%,高于潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)組11.3%(X2=6.8,P0.01)和其他疾病對照組組12.6%(X2=8.0,P0.01),與AIH組(20.5%)、LDC組(14.6%)和克羅恩病(Crohn's disease,CD)組(33.9%)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05); ASCA-IgG在PBC患者中的陽性率為13.6%,明顯低于CD組27.4%(X2=6.4,P0.05)和其他疾病對照組24.6%(X2=7.1,P0.01),與AIH組(15.9%)、LDC組(7.3%)和UC組(7.2%)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；ASCA-IgA或IgG陽性的PBC患者占29.8%,顯著低于CD組45.2%(X2=5.0,P0.05),高于UC組14.4%(X2=8.3,P0.01)和其他肝病對照組9.8%(X2=7.0,P0.01)�？笹P210抗體陽性的PBC患者ASCA陽性率高于抗GP210抗體陰性PBC患者(39.7%24.6%,X2=4.9,P0.05)；抗線粒體抗體(AMA)、抗SP100抗體陽性和陰性PBC患者間ASCA的陽性率差異無統(tǒng)計學意義。ASCA-IgA陽性PBC患者TBIL、DBIL、ALP、AST、TBA、LD、IgA、IgM、ESR高于ASCA-IgA陰性PBC患者,而ALB和CHE低于ASCA-IgA陰性PBC患者(P均0.05)。ASCA-IgG陽性PBC患者與陰性患者間肝功能損傷指標和免疫功能指標均無統(tǒng)計學差異。 研究結論 ASCA并不是炎癥性腸病特異性自身抗體,在PBC患者有較高的陽性率,且以IgA亞型為主。ASCA-IgA與PBC患者肝功能損傷指標和免疫活動指標改變有關,而ASCA-IgG與PBC患者肝功能損傷指標和免疫活動指標改變無關。
【學位單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

制了4X12=48個方陣，每個方陣為32x25=800蛋白點，每個方陣的起始和結束兩點均為人工gG(0.1微克/微升)，起始人工gG樣品后是小鼠IgG作為對照。用抗GST抗體對芯片進行檢測，監(jiān)測芯片制備的質(zhì)量。如圖2所示，芯片上檢測到的GST陽性點為紅色或白色(信號飽和)。每個點的前景信號值減去其背景值為該點的信號值，如果其信號值大于背景值的兩倍，則該點被認為是有陽性信號。根據(jù)這一標準，97.6%的蛋白質(zhì)可被檢測到。以每個蛋白質(zhì)樣品的2個重復點的信號強度作為x值和y值做散點圖，其線性相關系數(shù)為0.98，表明點樣具有良好的重復性(圖3)。圖2人類基因組編碼蛋白高通量芯片芯片實物及雜交圖全貌2.人類基因組編碼蛋白高通量芯片與血清的反應結果本研究用采用包含38400個蛋白點， 17718個人類重組蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片與PBC患者血清孵育，同時用AIH患者和其他自身免疫性疾病患者作為疾病對照組

值大于背景值的兩倍，則該點被認為是有陽性信號。根據(jù)這一標準，97.6%的蛋白質(zhì)可被檢測到。以每個蛋白質(zhì)樣品的2個重復點的信號強度作為x值和y值做散點圖，其線性相關系數(shù)為0.98，表明點樣具有良好的重復性(圖3)。圖2人類基因組編碼蛋白高通量芯片芯片實物及雜交圖全貌2.人類基因組編碼蛋白高通量芯片與血清的反應結果本研究用采用包含38400個蛋白點， 17718個人類重組蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片與PBC患者血清孵育，同時用AIH患者和其他自身免疫性疾病患者作為疾病對照組，以健康人血清作為健康對照與芯片反應。如果血清中含有針對芯片上蛋白質(zhì)探針的抗體，則能與之結合，研究中采用Cys標一記的抗人工gG抗體檢測這種特異性結合的工gG抗體，用能夠

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院碩士研究生學位論文檢測到Cys信號的芯片掃描儀掃描，讀取芯片探針與血清中抗體反應的信號，圖4所示為所有芯片檢測信號強度概況圖。側延些名扭幽燃中11紙01以洲洲】21魷洲幻3口以扣月以X幻5側義幻6側沉舊7以知舊第一蛋白點的信號強度圖3人類基因組編碼蛋白高通量芯片相同蛋白復點蛋白信號強度相關性。圖4所有芯片信號強度平均值3.人類基因組編碼蛋白高通量芯片篩選PBC患者血清標志物高通量芯片篩選結果經(jīng)統(tǒng)計分析，只0.01的PBC標志物共18個。其敏感性最好的5個標志物中針對PDHAI、D盯和DLAT的抗體為現(xiàn)在已經(jīng)使用的PBC標志物AMA一MZ組成部分，針對HKI和ZNF364的抗體為新發(fā)現(xiàn)的PBC標志物，而且這兩個標志物在對照組中均為陰性，因此其特異性較好，可能有應用價值。詳細篩選結果見表2。圖5所示為

【引證文獻】

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1 吳虹杰;探討Anti-ASGPR在AIH-1生物學特性中的意義[D];鄭州大學;2012年

本文編號：2816000