研究背景 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種以多見于女性的慢性自身免疫性肝臟疾病,其發(fā)病機(jī)制至今仍沒有完全闡明,PBC的血清標(biāo)志物在PBC的診斷中具有無可替代的作用,但目前使用的PBC血清標(biāo)志物并不理想,因此用新的研究手段進(jìn)行PBC血清標(biāo)志物的研究顯得非常重要。 研究方法 以人類cDNA文庫為模板,設(shè)計(jì)目的基因的特異引物,將PCR擴(kuò)增的目的基因產(chǎn)物和線性化的酵母表達(dá)質(zhì)粒pEGH共轉(zhuǎn)染酵母Y258。利用半乳糖誘導(dǎo)含有目的基因的酵母克隆表達(dá)重組蛋白。通過谷胱甘肽親和層析柱純化含GST標(biāo)簽?zāi)康闹亟M蛋白點(diǎn)制高通量芯片。采用人類基因組編碼蛋白高通量芯片篩選原發(fā)性膽汁性肝硬化血清,尋找PBC特異性血清標(biāo)志物。 研究結(jié)果 制備的高通量蛋白芯片共計(jì)38 400個蛋白點(diǎn),含17 718個人類基因編碼蛋白,該芯片蛋白點(diǎn)的檢出率為97.6%,蛋白復(fù)點(diǎn)間檢測信號強(qiáng)度的相關(guān)系數(shù)為0.98。該芯片在PBC組與對照組間篩選出18個具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)標(biāo)志物。在最好的5個標(biāo)志物中,針對PDHA1、DBT和DLAT的抗體為現(xiàn)在已經(jīng)使用的PBC標(biāo)志物AMA-M2組成部分,針對HKl和ZNF364的抗體為新發(fā)現(xiàn)的PBC標(biāo)志物,在PBC中的陽性率分別為52.38%(11／21)和38.10%(8／21),在對照組中的陽性率均為0.00%(0／30)。AMA-M2陽性與AMA—M2陰性PBC患者間沒發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的血清標(biāo)志物。ACA陽性與ACA陰性PBC患者間僅針對CENPB的抗體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 研究結(jié)論 人類基因組編碼蛋白高通量芯片是一種快速全面篩選PBC新標(biāo)志物的技術(shù)。針對HKl和ZNF364的抗體具有較好的敏感性和特異性,可以作為PBC新標(biāo)志物。AMA-M2陽性與AMA-M2陰性PBC患者間沒發(fā)現(xiàn)具有意義的血清標(biāo)志物,所謂的AMA-M2陰性患者可能是由于檢測方法所致的假陰性。PBC患者的ACA以B亞型為主,而針對CENPB的抗體可以作為ACA陽性與ACA陰性PBC患者間的標(biāo)志物。 研究目的 檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者血清抗釀酒酵母細(xì)胞抗體(ASCA),探討其在PBC中的陽性狀況以及與其他PBC自身抗體的關(guān)系和臨床意義。研究方法 采用ELISA檢測198例PBC患者、44例自身免疫性肝炎(AIH)患者、41例肝病對照組(LDC)患者、169例炎癥性腸病(IBD)患者及167例其他疾病對照組患者血清ASCA的IgA和IgG亞型,分析該抗體與各種指標(biāo)的相互關(guān)系。 研究結(jié)果 ASCA-IgA在PBC患者中的陽性率為24.2%,高于潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)組11.3%(X2=6.8,P0.01)和其他疾病對照組組12.6%(X2=8.0,P0.01),與AIH組(20.5%)、LDC組(14.6%)和克羅恩病(Crohn's disease,CD)組(33.9%)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); ASCA-IgG在PBC患者中的陽性率為13.6%,明顯低于CD組27.4%(X2=6.4,P0.05)和其他疾病對照組24.6%(X2=7.1,P0.01),與AIH組(15.9%)、LDC組(7.3%)和UC組(7.2%)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；ASCA-IgA或IgG陽性的PBC患者占29.8%,顯著低于CD組45.2%(X2=5.0,P0.05),高于UC組14.4%(X2=8.3,P0.01)和其他肝病對照組9.8%(X2=7.0,P0.01)�？笹P210抗體陽性的PBC患者ASCA陽性率高于抗GP210抗體陰性PBC患者(39.7%24.6%,X2=4.9,P0.05)；抗線粒體抗體(AMA)、抗SP100抗體陽性和陰性PBC患者間ASCA的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ASCA-IgA陽性PBC患者TBIL、DBIL、ALP、AST、TBA、LD、IgA、IgM、ESR高于ASCA-IgA陰性PBC患者,而ALB和CHE低于ASCA-IgA陰性PBC患者(P均0.05)。ASCA-IgG陽性PBC患者與陰性患者間肝功能損傷指標(biāo)和免疫功能指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 研究結(jié)論 ASCA并不是炎癥性腸病特異性自身抗體,在PBC患者有較高的陽性率,且以IgA亞型為主。ASCA-IgA與PBC患者肝功能損傷指標(biāo)和免疫活動指標(biāo)改變有關(guān),而ASCA-IgG與PBC患者肝功能損傷指標(biāo)和免疫活動指標(biāo)改變無關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

制了4X12=48個方陣，每個方陣為32x25=800蛋白點(diǎn)，每個方陣的起始和結(jié)束兩點(diǎn)均為人工gG(0.1微克/微升)，起始人工gG樣品后是小鼠IgG作為對照。用抗GST抗體對芯片進(jìn)行檢測，監(jiān)測芯片制備的質(zhì)量。如圖2所示，芯片上檢測到的GST陽性點(diǎn)為紅色或白色(信號飽和)。每個點(diǎn)的前景信號值減去其背景值為該點(diǎn)的信號值，如果其信號值大于背景值的兩倍，則該點(diǎn)被認(rèn)為是有陽性信號。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，97.6%的蛋白質(zhì)可被檢測到。以每個蛋白質(zhì)樣品的2個重復(fù)點(diǎn)的信號強(qiáng)度作為x值和y值做散點(diǎn)圖，其線性相關(guān)系數(shù)為0.98，表明點(diǎn)樣具有良好的重復(fù)性(圖3)。圖2人類基因組編碼蛋白高通量芯片芯片實(shí)物及雜交圖全貌2.人類基因組編碼蛋白高通量芯片與血清的反應(yīng)結(jié)果本研究用采用包含38400個蛋白點(diǎn)， 17718個人類重組蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片與PBC患者血清孵育，同時用AIH患者和其他自身免疫性疾病患者作為疾病對照組

值大于背景值的兩倍，則該點(diǎn)被認(rèn)為是有陽性信號。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，97.6%的蛋白質(zhì)可被檢測到。以每個蛋白質(zhì)樣品的2個重復(fù)點(diǎn)的信號強(qiáng)度作為x值和y值做散點(diǎn)圖，其線性相關(guān)系數(shù)為0.98，表明點(diǎn)樣具有良好的重復(fù)性(圖3)。圖2人類基因組編碼蛋白高通量芯片芯片實(shí)物及雜交圖全貌2.人類基因組編碼蛋白高通量芯片與血清的反應(yīng)結(jié)果本研究用采用包含38400個蛋白點(diǎn)， 17718個人類重組蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片與PBC患者血清孵育，同時用AIH患者和其他自身免疫性疾病患者作為疾病對照組，以健康人血清作為健康對照與芯片反應(yīng)。如果血清中含有針對芯片上蛋白質(zhì)探針的抗體，則能與之結(jié)合，研究中采用Cys標(biāo)一記的抗人工gG抗體檢測這種特異性結(jié)合的工gG抗體，用能夠

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文檢測到Cys信號的芯片掃描儀掃描，讀取芯片探針與血清中抗體反應(yīng)的信號，圖4所示為所有芯片檢測信號強(qiáng)度概況圖。側(cè)延些名扭幽燃中11紙01以洲洲】21魷洲幻3口以扣月以X幻5側(cè)義幻6側(cè)沉舊7以知舊第一蛋白點(diǎn)的信號強(qiáng)度圖3人類基因組編碼蛋白高通量芯片相同蛋白復(fù)點(diǎn)蛋白信號強(qiáng)度相關(guān)性。圖4所有芯片信號強(qiáng)度平均值3.人類基因組編碼蛋白高通量芯片篩選PBC患者血清標(biāo)志物高通量芯片篩選結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，只0.01的PBC標(biāo)志物共18個。其敏感性最好的5個標(biāo)志物中針對PDHAI、D盯和DLAT的抗體為現(xiàn)在已經(jīng)使用的PBC標(biāo)志物AMA一MZ組成部分，針對HKI和ZNF364的抗體為新發(fā)現(xiàn)的PBC標(biāo)志物，而且這兩個標(biāo)志物在對照組中均為陰性，因此其特異性較好，可能有應(yīng)用價值。詳細(xì)篩選結(jié)果見表2。圖5所示為

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 吳虹杰;探討Anti-ASGPR在AIH-1生物學(xué)特性中的意義[D];鄭州大學(xué);2012年

本文編號：2816000