第一部分胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的原代、傳代培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 目的完成胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng),成功轉(zhuǎn)染PDX-1基因進(jìn)入胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。 方法用含有膠原酶V型的消化液對(duì)大鼠胰腺組織進(jìn)行消化分離,接著用梯度離心法將導(dǎo)管上皮細(xì)胞分離純化,在體外經(jīng)RPMI1640及含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液培養(yǎng),在達(dá)到80%～90%的細(xì)胞匯合時(shí),1∶2傳代培養(yǎng)。傳代3～5次后接種于6孔板中轉(zhuǎn)染重組載體PDX-1(XlHbox8VP16),分轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組。 結(jié)果獲得的原代培養(yǎng)細(xì)胞有上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)排列方式,可初步認(rèn)定為胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。原代培養(yǎng)的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞可傳代培養(yǎng)到第3～5代不等。 結(jié)論我們的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法能在體外培養(yǎng)出較純的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞,并能進(jìn)行成功轉(zhuǎn)染PDX-1。 第二部分體外轉(zhuǎn)染PDX-1在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化中的作用及衍生胰島細(xì)胞功能鑒定 目的體外觀察轉(zhuǎn)染PDX-1對(duì)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞的作用。 方法對(duì)轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),取各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中PDX-1,胰島素mRNA的表達(dá)。Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中PDX-1,胰島素蛋白的表達(dá)。放射免疫法測(cè)定衍生胰島細(xì)胞的分泌功能,雙硫腙染色檢測(cè)胰島細(xì)胞。 結(jié)果轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中有XlHbox8 mRNA的表達(dá),且PDX-1,胰島素mRNA以及蛋白的表達(dá)也增加。生成的胰島細(xì)胞數(shù)量及胰島素分泌量明顯增加(葡萄糖濃度5.6 mmol/L時(shí)胰島素分泌量1.32±0.43 vs 3.48±0.81,葡萄糖濃度16.7 mmol/L時(shí)胰島素分泌量4.86±1.15 vs 10.25±1.32),差異有顯著性(P0.01)。 結(jié)論P(yáng)DX-1能顯著促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞。用此法獲得大量的胰島可能為糖尿病治療提供一條新的途徑。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R576
【部分圖文】：

圖 1.1 取材(A 左右肝管匯合處血管鉗結(jié)扎；B 注入消化液的胰腺)圖 1.2 胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)（A 培養(yǎng)第一周；B 傳代培養(yǎng)一周 40×10）

胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)（A培養(yǎng)第一周；B傳代培養(yǎng)一周40×10）

圖 1.1 取材(A 左右肝管匯合處血管鉗結(jié)扎；B 注入消化液的胰腺)圖 1.2 胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)（A 培養(yǎng)第一周；B 傳代培養(yǎng)一周 40×10）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉濤,范驥,王春友;轉(zhuǎn)錄因子PDX-1在豬胰干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)及意義[J];胰腺病學(xué);2003年01期

2 ;Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cells[J];World Journal of Gastroenterology;2004年20期

本文編號(hào)：2813110