慢性乙肝病毒(HBV)的感染是個(gè)全球性的健康衛(wèi)生問題,世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)全球有近4億人為慢性乙肝病毒攜帶者,許多慢性HBV感染者最終發(fā)生嚴(yán)重的肝臟疾病包括慢性肝炎、肝硬變和肝細(xì)胞肝癌,這些疾病每年導(dǎo)致約近一百萬人死亡。APOBEC3s具有針對(duì)多種逆轉(zhuǎn)錄病毒和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件的強(qiáng)大的天然免疫功能,近年來陸續(xù)有報(bào)道多個(gè)APOBEC3s蛋白具有抑制HBV復(fù)制的作用,并且其表達(dá)能被IFN、IL-2和TNF等細(xì)胞因子誘導(dǎo),并且有報(bào)道APOBEC3s對(duì)HBV的抑制作用并不完全依賴于脫氨酶活性。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)A3B能抑制HBV s基因啟動(dòng)子的活性并能通過與hnRNPK的結(jié)合抑制HBV的復(fù)制。綜合先前的研究,我們用多種分子生物學(xué)技術(shù)探究A3DE對(duì)HBV是否具有抑制作用；該抑制作用是否依賴于脫氨酶活性；其表達(dá)能否被細(xì)胞因子誘導(dǎo)上調(diào);并對(duì)A3B對(duì)HBV的抑制機(jī)制作補(bǔ)充。本研究分為以下三個(gè)部分： 第一部分 體外細(xì)胞系中APOBEC3DE對(duì)HBV的抑制作用及其機(jī)制研究 本部分旨在了解APOBEC3s家族中哪些成員對(duì)HBV HBsAg和HBeAg水平具有抑制作用,同時(shí)對(duì)被選出的A3DE進(jìn)一步探索其抑制HBV的作用機(jī)制。 我們做了APOBEC3s蛋白對(duì)HBV HBsAg和HBeAg表達(dá)水平的影響的一系列研究。通過體外瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),分別將HBV表達(dá)質(zhì)粒與A3s真核表達(dá)質(zhì)�；�?qū)φ湛蛰d體pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2中,應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法(ECLIA)測(cè)定轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,A3B和A3DE對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制作用最為顯著,HBsAg和HBeAg的表達(dá)分別為對(duì)照組的18.48%±1.88%和28.37%±1.18%以及11.06%±0.44%和22.87%±0.9%；與A3B和A3DE相比,A3F.A3G和A3H對(duì)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg水平的抑制作用要弱得多,分別為對(duì)照組的39.53±5.97%和40.44%±1.05%,44.34±3.23%和52.74%±0.81%以及65.52±11.96%和57.1%±5.72%；A3A對(duì)HBsAg和HBeAg抑制作用很弱,為86.38±7.38%和91.82%±4.94%；而A3C對(duì)其無抑制作用,兩蛋白表達(dá)水平分別為110.4±5.3%和91.82±4.94%。 我們用PCR突變技術(shù)構(gòu)建了A3DE酶活性中心的點(diǎn)突變體,以觀察A3DE對(duì)HBV HBsAg和HBeAg表達(dá)抑制是否依賴于脫氨酶活性,結(jié)果顯示A3DE對(duì)其的抑制并未受到酶活性中心突變的影響。進(jìn)一步分析A3DE及其三個(gè)突變體對(duì)HIV-1病毒感染力的影響,與HBV不同的是,A3DE對(duì)Vif缺陷的HIV-1病毒感染力為對(duì)照組的2.94%±0.12%,而E80K、E80/264K和E264K分別為42.84%±6.78%,38.76%±8.92%和13.59%±3.12%,即對(duì)HIV-1感染率的抑制分別下降了大約39%,35%和10%,并且只有野生型A3DE包被在人HIV-1病毒中。 為揭示A3DE能否抑制HBV基因表達(dá),我們分析了上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBV s基因的mRNA表達(dá)。提取上述共轉(zhuǎn)染48h后HepG2細(xì)胞總RNA,通過半定量RT-PCR方法檢測(cè)HBV s基因的mRNA水平,結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染A3DE和HBV表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中s基因mRNA水平與對(duì)照相比明顯降低,提示A3DE能抑制s基因mRNA的表達(dá)。并且其突變體也能抑制其表達(dá)，上述兩個(gè)結(jié)果表明A3DE既能抑制HBsAg蛋白的表達(dá),又能抑制s基因mRNA表達(dá)。 接著觀察A3DE蛋白對(duì)HBV core DNA合成的影響。將HBV質(zhì)粒與A3DE表達(dá)載體或?qū)φ湛蛰d體VR1012共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,提取和純化轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞內(nèi)的HBV core相關(guān)DNA,并應(yīng)用定量PCR方法對(duì)其定量,用3D-PCR技術(shù)檢測(cè)A3DE能否突變HBV基因組。結(jié)果顯示A3DE不能抑制HBV core相關(guān)DNA的合成,但是能突變HBV X基因DNA。 第二部分 A3DE在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及其調(diào)控研究 這部分研究檢測(cè)了A3DE在外周血單個(gè)核細(xì)胞、多株人肝細(xì)胞系和白血病細(xì)胞系、及肝組織中的表達(dá)情況,觀察IFN和TNF刺激對(duì)A3DE表達(dá)的影響,旨在揭示ADE在體內(nèi)表達(dá)的調(diào)控和作用。 應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)了原代標(biāo)本和細(xì)胞系A(chǔ)3DE的表達(dá)情況。7例健康成人外周血單個(gè)核白細(xì)胞中均有A3DE表達(dá)。表達(dá)存在著個(gè)體差異,其中有一例標(biāo)本A3DE的表達(dá)呈較低水平,其余6例表達(dá)較強(qiáng)。HepG2.2.15由HepG2細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建而成,前者的A3DE表達(dá)高于后者約1.5倍,這表明HBV的感染激發(fā)了細(xì)胞內(nèi)A3DE的增高。在5株肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系和2株人正常肝細(xì)胞系中,A3DE有一定的表達(dá),其中Huh-7細(xì)胞中的A3DE表達(dá)相對(duì)最高,但是這些細(xì)胞系細(xì)胞中的本底表達(dá)并不高,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及外周血單個(gè)核細(xì)胞。但人白血病細(xì)胞系中A3DE的表達(dá)水平不低于外周血單個(gè)核細(xì)胞。 為探討A3DE在肝組織中的表達(dá)我們分析了16對(duì)配對(duì)人肝癌和癌旁肝組織中A3DE基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在16對(duì)肝癌或癌旁組織中均有A3DE的表達(dá),表達(dá)水平各有高低,對(duì)A3DE與GAPDH電泳條帶的灰度比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)肝癌和癌旁A3DE的表達(dá)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.1219)。 接著檢測(cè)了IFN和TNF刺激肝細(xì)胞系對(duì)A3DE表達(dá)的效應(yīng)。結(jié)果顯示4株人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系和1株人正常肝細(xì)胞系細(xì)胞中的A3DE表達(dá)均能被IFN和TNF上調(diào),以QGY-7703的上調(diào)最為顯著,不同細(xì)胞株上調(diào)的程度和時(shí)間點(diǎn)的持續(xù)各有不同。綜合第一二部分結(jié)果我們認(rèn)為A3DE具有抗HBV復(fù)制能力,其表達(dá)和調(diào)控對(duì)HBV感染的預(yù)后和治療有積極的提示意義。 第三部分 A3B對(duì)HBV復(fù)制的抑制不依賴于N端和C端的胞嘧啶脫氨酶 本部分的實(shí)驗(yàn)方法與第一部分類似。我們先前研究發(fā)現(xiàn)A3B能抑制HBV s基因的啟動(dòng)子活性并能通過與hnRNPK的結(jié)合來抑制HBV Enh II的作用,為進(jìn)一步補(bǔ)充其抑制機(jī)制,構(gòu)建了A3B兩端的酶活性中心點(diǎn)突變體,用共轉(zhuǎn)染和免疫沉淀技術(shù)驗(yàn)證A3B酶活性失活后仍能抑制HBV復(fù)制并與hnRNP K的結(jié)合不受影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,以對(duì)照組中HBsAg和HBeAg的表達(dá)為100%, A3B、C100S、C289S和C100/289S中HBsAg的表達(dá)分別為對(duì)照組的18.98%±1.81%、17%±0.84%、20.89%±0.65%和19.39%±1.22%；HBeAg的表達(dá)為對(duì)照組的30%±2.8%27.45%±0.58%、33.05%±±2.54%和32.39%±±4.24%,突變體對(duì)HBV的抑制并不低于野生型A3B。通過RT-PCR方法檢測(cè)HBVs基因mRNA水平,與對(duì)照相比,A3B和其突變體的HepG2細(xì)胞中的s基因mRNA水平明顯降低。最后免疫共沉淀(IP)方法證實(shí)A3B三個(gè)突變體蛋白與野生型A3B相比,與hnRNP K的結(jié)合能力未受影響。這部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了脫氨基作用并非A3B抑制HBV復(fù)制的主要手段,為APOBEC3s抑制HBV研究提供了新的方向。 綜合前兩部分研究得出結(jié)論：A3DE具有不依賴于胞嘧啶脫氨酶活性的強(qiáng)大的抗HBV復(fù)制的能力；與A3B不同,A3DE的表達(dá)與人肝細(xì)胞肝癌發(fā)生無關(guān),其表達(dá)能被IFN和TNF等細(xì)胞因子誘導(dǎo)上調(diào)；A3B和A3DE對(duì)HBV復(fù)制的抑制都不依賴于兩端的脫氨酶活性,說明脫氨基作用并非A3B和A3DE抑制HBV的主要手段;這些結(jié)果為APOBEC3s蛋白抗HBV病毒機(jī)制研究提供了新的思路并為人類乙型肝炎病毒的治療提供了新的方向。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;Interferon-alfa in the treatment of chronic hepatitis B[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2004年03期

2 ;Inhibition of hepatitis B virus replication by APOBEC3G in vitro and in vivo[J];World Journal of Gastroenterology;2006年28期

3 Juergen Beck;Michael Nassal;;Hepatitis B virus replication[J];World Journal of Gastroenterology;2007年01期

本文編號(hào)：2809864