慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起的可能威脅生命的肝臟疾病。它是一個(gè)嚴(yán)重的全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。它可造成慢性肝病和慢性感染且患者死于肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)很高。目前在中國(guó)被批準(zhǔn)用于治療CHB的藥物有兩大類:一類是免疫調(diào)節(jié)劑,包括干擾素(interferon-α,IFN)和聚乙二醇化干擾素(長(zhǎng)效干擾素,pegylated interferon-α,PEG-IFN);另一類是核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogue,NA),包括拉米夫定(lamivudine,LAM)、阿德福韋酯(adefovir dipivoxil,ADV)、恩替卡韋(entecavir,ETV)和替比夫定(telbivudine,Ld T)。盡管NAs比IFN有口服方便、毒副作用小及抗病毒療效好且迅速使HBV DNA水平降低等優(yōu)點(diǎn)。然而,長(zhǎng)期使用NAs會(huì)導(dǎo)致病毒耐藥幾率的增加。病毒耐藥和患者依從性差都是治療失敗的關(guān)鍵性影響因素。由于對(duì)未用過(guò)NAs治療和使用NAs治療的CHB患者體內(nèi)HBV逆轉(zhuǎn)酶區(qū)(Reverse transcriptase,RT)潛在的耐藥相關(guān)突變的差異的研究甚少,因此,本論文第一章依次采用半巢式PCR、PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法或克隆測(cè)序法以及生物信息學(xué)方法對(duì)169例未用NAs治療和131例使用NAs治療的患者的HBV RT區(qū)NAs耐藥相關(guān)突變進(jìn)行分析,其中HBV基因型B和C感染者分別占76.7%和23.3%。通過(guò)對(duì)NAs未治療組和NAs治療組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)在B和C基因型分布及男女比例上,兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而,NAs未治療組的年齡、血清中HBV DNA的水平以及HBV E抗原陽(yáng)性率顯著高于NAs治療組。通過(guò)比較HBV基因型B和C之間的突變分布發(fā)現(xiàn)基因型C中的RT區(qū)突變率和突變頻率顯著高于基因型B,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在300例CHB患者中,有155例發(fā)現(xiàn)了單個(gè)或多重突變。其中帶有多重突變的患者的血清HBV DNA的水平顯著低于沒有突變或單個(gè)突變的患者。同樣,在HBV B或C基因型感染者中,HBV DNA的復(fù)制水平在帶有多重突變的患者中要低于沒有突變的患者。并且沒有突變的患者中的E抗原陽(yáng)性率顯著高于帶有單個(gè)或多重突變的患者,且?guī)в卸嘀赝蛔兊幕颊咧饕娪诨蛐虲感染者。在篩查的42個(gè)潛在的NAs耐藥位點(diǎn)中,本研究只發(fā)現(xiàn)了17個(gè),且在11個(gè)新位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了13種氨基酸變異。值得注意的是,在這些新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)中,rt I187V和rt N226H在NAs治療組中的突變率相對(duì)于其它新突變位點(diǎn)要高。已知的主要耐藥和次要/代償變異僅出現(xiàn)在NAs治療組的7個(gè)氨基酸位點(diǎn),且在這兩組中均發(fā)現(xiàn)了預(yù)測(cè)的抗病毒藥物耐藥變異和治療前突變分布在10個(gè)位點(diǎn)包括11種氨基酸變異。在主要耐藥變異和代償變異中,且發(fā)現(xiàn)有4個(gè)位點(diǎn)突變與LAM治療顯著相關(guān)(204、80、173、180)。而181及236位點(diǎn)則與ADV治療顯著相關(guān)。對(duì)于預(yù)測(cè)的抗病毒藥物耐藥變異和治療前突變,有四個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變與ADV治療顯著相關(guān),它們的突變率在ADV單療法中顯著高于其他4組,分別為191、213、214、221。而另一位點(diǎn)229與LAM治療顯著相關(guān),在14個(gè)L229突變中發(fā)現(xiàn)有13個(gè)在以LAM為初始藥物的治療中,并且都伴隨有M204V/I突變。這表明NAs治療不僅促進(jìn)一類二類主要耐藥突變的選擇而且還促使三類四類潛在的耐藥突變發(fā)生改變。本研究還發(fā)現(xiàn)HBV的NAr相關(guān)位點(diǎn)有一定的基因型偏好性。例如,Rt L180M突變主要出現(xiàn)C基因型感染者中,而帶有rt L80V突變的患者全部為B基因型感染者,且rt M204I和rt M204V突變分別偏好使用rt L80V和rt L180M作為補(bǔ)償突變。通過(guò)對(duì)基因型B和C感染的患者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)基因型C中帶有RT區(qū)突變的病毒基因組數(shù)、突變頻率以及帶有多重突變的幾率都顯著高于基因型B。相對(duì)與其它三種療法,LAM和ADV的序貫療法發(fā)生多重突變的幾率要顯著增高。在LAM聯(lián)合ADV治療組中,僅發(fā)現(xiàn)LAM耐藥相關(guān)突變,而在LAM和ADV序貫治療組,不僅發(fā)現(xiàn)LAM耐藥相關(guān)突變還發(fā)現(xiàn)ADV耐突變r(jià)t A181T。這說(shuō)明序貫療法可能增加ADV耐藥突變選擇出的幾率�？偠灾�,這些結(jié)果有助于我們了解NAs耐藥相關(guān)突變的進(jìn)化和選擇基礎(chǔ)以便更好的選擇抗病毒治療方法。而有關(guān)于預(yù)測(cè)的抗病毒藥物耐藥變異和治療前突變對(duì)抗病毒治療的影響還需要進(jìn)一步采用體外表型分析技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。本論文第二章研究對(duì)象主要是第一章中發(fā)現(xiàn)的新突變。我們的目的是建立及應(yīng)用體外表型分析技術(shù)對(duì)一個(gè)出現(xiàn)頻率很高的突變r(jià)t I187V進(jìn)行抗病毒藥物耐藥的評(píng)估。我們的目的在于評(píng)價(jià)單獨(dú)rt I187V突變或是聯(lián)合LAM經(jīng)典耐藥突變(rt M204I,rt L180M/rt M204V)時(shí)在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力以及對(duì)LAM和ADV的敏感性。首先用定點(diǎn)突變法構(gòu)建帶有突變r(jià)t I187V或聯(lián)合LAM經(jīng)典耐藥突變的復(fù)制型質(zhì)粒,并且分別以野生型及LAM或是ADV經(jīng)典耐藥突變作為陰性及陽(yáng)性對(duì)照,然后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系Hep G2進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn),最后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外的HBV DNA復(fù)制情況。在這300例CHB患者中,有8.7%(26/300)的患者體內(nèi)的HBV RT區(qū)的第187位氨基酸從異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸(即rt I187V)。在NAs未治療組及NAs治療組中均發(fā)現(xiàn)了此突變,且有15例單獨(dú)rt I187V突變存在于NAs未治療組中,而有10例與LAM耐藥突變聯(lián)合出現(xiàn)與含LAM的治療中。值得注意的是,突變r(jià)t I187V在基因型B中的突變率顯著高于基因型C。體外表型分析實(shí)驗(yàn)顯示與野生株對(duì)比,帶有突變r(jià)t I187V的病毒株的復(fù)制效率顯著降低。更有趣的是,突變r(jià)t I187V聯(lián)合LAM耐藥突變時(shí)則更進(jìn)一步的降低了LAM耐藥突變的復(fù)制效率。體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)顯示突變r(jià)t I187V對(duì)LAM和ADV仍然敏感,與野生株一致,而且當(dāng)rt I187V聯(lián)合LAM耐藥突變時(shí)對(duì)LAM仍然耐藥而對(duì)ADV依然敏感。綜上所述,本部分研究探討了HBV RT區(qū)的一個(gè)高突變率的突變r(jià)t I187V,并且此突變?cè)诨蚪MB中的突變率很高。體外表型分析實(shí)驗(yàn)顯示rt I187V突變的出現(xiàn)并不影響自身及LAM耐藥突變對(duì)抗病毒藥物的敏感性。然而,帶有此突變的病毒株會(huì)使自身或LAM耐藥突變株的復(fù)制效率顯著降低。因此,我們認(rèn)為突變r(jià)t I187V可能構(gòu)成了HBV RT區(qū)氨基酸多態(tài)性的背景而不是影響藥物敏感性的耐藥突變。因此,對(duì)于帶有rt I187V聯(lián)合LAM耐藥突變的患者,在沒有新的代償變異出現(xiàn)的情況下使用ADV治療以降低選擇出LAM代償變異的幾率。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R512.62


本文編號(hào)：2809734