細(xì)菌脂多糖(LPS)和氨基半乳糖(GalN)共處理誘導(dǎo)以肝臟細(xì)胞凋亡為主要特征的急性肝損傷,腫瘤壞死因子α(TNF-α)在GalN/LPS引起小鼠急性凋亡性肝損傷過程中起關(guān)鍵作用。體外研究發(fā)現(xiàn),核因子κB(NF-κB)激活對(duì)抗TNF-α介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,而外源性活性氧(ROS)或內(nèi)源性氧化應(yīng)激均可加重TNF-α介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。本課題通過深入研究NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)及抗氧化劑褪黑素(MT)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)分別對(duì)GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷的不同效應(yīng),繼而闡明NF-κB激活和ROS生成在GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷中的不同作用。 1.PDTC對(duì)GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷的效應(yīng) 目的通過研究PDTC對(duì)GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷的效應(yīng),以闡明NF-κB在LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷中的作用。方法本研究設(shè)置生理鹽水(NS)組、LPS組、GalN組、GalN/LPS組、PDTC+GalN/LPS組和PDTC組。GalN/LPS組同時(shí)給予小鼠LPS(20μg/kg,i.p.)和GalN(600 mg/kg,i.p.),PDTC+GalN/LPS組小鼠于LPS(20μg/kg,i.p.)處理前24 h和2 h分別經(jīng)腹腔注射PDTC(100+100 mg/kg),LPS組、GalN組和PDTC組分別給予小鼠LPS(20μg/kg,i.p.)、GalN(600 mg/kg,i.p.)和PDTC(100+100 mg/kg),NS組小鼠給予等容積生理鹽水。每組10只小鼠被用于觀察LPS處理后72 h內(nèi)的動(dòng)物死亡情況;每組6只小鼠經(jīng)LPS處理后1.5 h被取血、處死并留取肝臟,用RT-PCR檢測(cè)肝臟組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平,用EMSA分析肝臟NF-κB結(jié)合活性,用ELISA測(cè)定血清TNF-α含量;每組12只小鼠于LPS處理后8 h取血、處死并留取肝臟,測(cè)定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活力、一氧化氮(NO)水平和肝組織還原性谷胱甘肽(GSH)含量,用比色法檢測(cè)肝臟caspase-3活性,用TUNEL技術(shù)和DNA斷裂分析方法檢測(cè)肝臟細(xì)胞凋亡,并對(duì)肝組織切片行常規(guī)HE染色。結(jié)果GalN/LPS共處理顯著升高小鼠血清ALT活力;肝臟組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),GalN/LPS組小鼠肝臟嚴(yán)重充血、壞死并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝臟組織TUNEL陽性細(xì)胞顯著增多;GalN/LPS處理的小鼠肝臟組織caspase-3活性明顯升高;在GalN/LPS共處理72 h內(nèi)有90%小鼠發(fā)生死亡,所有死亡小鼠均伴有肝臟嚴(yán)重充血。PDTC預(yù)處理抑制GalN/LPS誘導(dǎo)的肝臟NF-κB激活和TNF-α表達(dá),但PDTC預(yù)處理反而加重GalN/LPS引起的小鼠肝臟細(xì)胞凋亡、進(jìn)一步升高血清ALT活力、加重肝臟充血和壞死并加速小鼠死亡。結(jié)論NF-κB抑制劑PDTC通過抑制肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞NF-κB介導(dǎo)的抗凋亡機(jī)制加重GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性凋亡性肝損傷。 2.MT對(duì)GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷的效應(yīng) 目的通過探討MT對(duì)GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷的效應(yīng),以闡明ROS在LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷中的作用。方法實(shí)驗(yàn)小鼠被隨機(jī)分為3組。GalN/LPS組小鼠被同時(shí)給予GalN(600 mg/kg,i.p.)和LPS(20μg/kg,i.p.);MT+GalN/LPS于GalN/LPS處理前0.5 h給予MT(5.0 mg/kg,i.p.),且在GalN/LPS處理后1 h、2 h再分別腹腔給予MT(2.5 mg/kg)處理;NS組小鼠經(jīng)腹腔注射等容積生理鹽水。經(jīng)GalN/LPS處理8 h后,摘眼球取血、處死并取肝臟,檢測(cè)血清ALT活力、TNF-α和NO水平,測(cè)定肝臟組織caspase-3活性、還原性GSH含量、GSH-Px活性和GSH-Rd活性,采用DNA梯度分析方法檢測(cè)肝臟細(xì)胞凋亡,并對(duì)小鼠部分肝臟行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果GalN/LPS處理顯著升高小鼠血清ALT活力,引起小鼠肝臟組織嚴(yán)重充血、壞死并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而且GalN/LPS明顯升高小鼠肝臟組織caspase-3活性和增多肝臟凋亡細(xì)胞數(shù)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,MT處理明顯降低GalN/LPS升高的小鼠血清ALT活力。同時(shí),MT處理也明顯減輕肝臟充血和壞死。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MT明顯減輕GalN/LPS引起小鼠肝臟細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)為肝臟caspase-3活性下降和DNA斷裂的減少。而且,MT處理明顯減輕GalN/LPS引起的肝臟組織GSH損耗,顯著升高肝臟組織GSH-Rd和GSH-Px活性。結(jié)論抗氧化劑MT減弱GalN/LPS引起的小鼠急性凋亡性肝損傷。 3.NAC對(duì)GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷的效應(yīng) 目的通過探討N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷的效應(yīng),以闡明ROS在LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝損傷中的作用。方法雌性ICR小鼠被隨機(jī)分成4組。除NS組外,所有小鼠均被同時(shí)給予GalN(600 mg/kg,i.p.)和LPS(20μg/kg,i.p.);NAC/GalN/LPS組小鼠于GalN/LPS共處理前30 min給予NAC(150 mg/kg,i.p.);BSO/NAC/GalN/LPS組小鼠于GalN/LPS共處理前12 h和2 h被分別注射BSO(100 mg/kg,i.p.),并于GalN/LPS共處理前30 min給予NAC(150 mg/kg,i.p.);NS組小鼠經(jīng)腹腔注射給予等容量生理鹽水。GalN/LPS處理1.5 h后,部分動(dòng)物被剖殺、取血,并測(cè)定血清TNF-α含量;于GalN/LPS處理8 h后,剩余動(dòng)物被剖殺、取血和肝臟,測(cè)定血清ALT活力和NO水平,檢測(cè)肝臟組織caspase-3活性與GSH含量,采用DNA斷裂分析方法檢測(cè)肝臟凋亡,并對(duì)部分小鼠肝臟行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果GalN/LPS處理顯著升高小鼠血清ALT活力,引起小鼠肝臟組織嚴(yán)重充血、壞死并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而且GalN/LPS明顯升高小鼠肝臟組織caspase-3活性和增多肝臟凋亡細(xì)胞數(shù)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,NAC處理明顯降低GalN/LPS升高的小鼠血清ALT活力。同時(shí),NAC處理也明顯減輕肝臟充血和壞死。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NAC明顯減輕GalN/LPS引起小鼠肝臟細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)為肝臟caspase-3活性下降和DNA斷裂的減少。而且,NAC處理明顯減輕GalN/LPS引起的肝臟組織還原型GSH損耗。結(jié)論抗氧化劑NAC保護(hù)GalN/LPS引起的小鼠急性凋亡性肝損傷。 綜上所述,本研究可得出如下結(jié)論:NF-κB激活在LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝臟損傷中起保護(hù)作用,而ROS生成在LPS誘導(dǎo)小鼠急性凋亡性肝臟損傷中起促進(jìn)作用。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

計(jì)學(xué)處理肝臟組織 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 mRNA 水平用同一樣品 GAP結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（—x ±s）表示，計(jì)量資料用 t 檢驗(yàn)和方差計(jì)學(xué)差異，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 為組間差異C 對(duì) GalN/LPS 誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的效應(yīng)TC 對(duì) GalN/LPS 引起小鼠死亡的影響給予 GalN 或 LPS 未觀察到小鼠死亡；GalN+LPS 聯(lián)合處理PS 處理后 16 h 內(nèi)死亡，而 PDTC＋GalN/LPS 組 90％小鼠死亡8 h 內(nèi)出現(xiàn)（圖 1）。

PDTC對(duì)GalN/LPS引起的肝臟組織病理學(xué)改變的影響A-F分別為NS組、GalN組、LPS組、GalN/LPS組、PDTC組和PDTC+GalN/LPS組，HE染放大200倍

20 3 PDTC 對(duì) GalN/LPS 誘導(dǎo)肝臟凋亡的影響 A：NS (1)、GalN (2)、LPS (3)、GalN/LPS (DTC (5)、PDTC/GalN/LPS (6)；B：與 NS 組比較， P < 0.05, P < 0.01；與 GalN/LPS 組，**P < 0.01；C：NS(a)、GalN(b)、LPS (c)、GalN/LPS (d)、PDTC (e)、PDTC/GalN/LPSig. 3 Effects of PDTC on GalN/LPS-induced hepatic apoptosis. (A) Hepatic DNA fragmentahe results are a representative of four independent experiments. NS (lane 1); GalN (lane 2); Lane 3); GalN/LPS (lane 4); PDTC (lane 5); PDTC+GalN/LPS (lane 6). (B) Hepatic caspasctivity (n = 12). P < 0.05, P < 0.01 as compared with NS group. **P < 0.01 as compared walN/LPS group. (C) TUNEL staining (arrow) of liver sections from mice treated with GalN/LPSDTC plus GalN/LPS. Magnification: 200×. (a) NS; (b) GalN; (c) LPS; (d) GalN/LPS; (e) PDTCDTC+GalN/LPS. Arrows show TUNEL-positive cells.

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