慢性乙型肝炎威脅全球人類健康,其中1/3以上的慢性感染者在中國。抗病毒治療是慢性乙型肝炎的核心治療措施。核苷類似物是目前抗病毒治療的主流藥物,隨著眾多新型核苷類似物的研發(fā)和逐漸上市,臨床用藥有了更多選擇。其中恩替卡韋(ETV)作為強(qiáng)效HBV抑制藥物已于近年上市,但目前尚缺乏對ETV長期治療的臨床觀察,及其與現(xiàn)有的主流核苷類似物如拉米夫定(LAM)長期療效對比的對照研究。 同時,這些核苷類似物在使用過程中遇到一系列難以回答的問題,諸如:①初治患者應(yīng)如何選擇核苷類抗病毒藥物;②核苷類似物耐藥的預(yù)防和處理;③核苷類似物可否聯(lián)合、序貫使用,如何使用;④停藥時機(jī)的把握等。我們注意到,核苷類似物的耐藥問題是上述問題的核心。目前核苷類似物的使用也主要把握兩點:一是充分發(fā)揮藥物的抗病毒功效,另一方面則是盡量避免耐藥的發(fā)生。然而目前臨床使用核苷類抗病毒藥物缺乏必要的實驗室依據(jù),同時對治療過程中病毒變異的分子病毒學(xué)過程和耐藥發(fā)生機(jī)制缺乏深入的了解,這是制約核苷類似物科學(xué)合理使用的關(guān)鍵問題。 準(zhǔn)種概念的引入為我們客觀認(rèn)識高變異病毒在宿主免疫和藥物等壓力下的運動規(guī)律提供了新的切入點。對HCV、HIV等高變異病毒的準(zhǔn)種研究發(fā)現(xiàn),這些病毒以種群選擇優(yōu)勢對抗環(huán)境壓力的改變,使種群得以延續(xù)。它們在宿主體內(nèi)以多變異株的形式混合存在,在一定的外界壓力下以某一或某些對當(dāng)前壓力具有選擇優(yōu)勢的變異株為優(yōu)勢準(zhǔn)種,且準(zhǔn)種群可隨著外界壓力的改變而發(fā)生演變以進(jìn)一步適應(yīng)環(huán)境。最近的研究發(fā)現(xiàn),HBV種群在核苷類似物治療過程中也可發(fā)生類似演變,且與HBV耐藥和抗病毒治療失敗密切相關(guān)。但由于均為個案研究,雖然為進(jìn)一步的研究提供了線索,但仍對這一問題缺乏系統(tǒng)深入的理解。同時,目前的研究方法仍以“PCR-克隆-測序”為“金標(biāo)準(zhǔn)”,尚缺乏對HBV準(zhǔn)種進(jìn)行精確、簡便檢測和篩選的研究方法。 為探討上述問題,本研究選擇了36例接受ETV或LAM治療的慢性乙型肝炎患者進(jìn)行了長達(dá)192周的隨訪觀察,其中17例LAM初治患者有14例接受了后續(xù)ETV序貫治療。我們對不同藥物治療的兩組患者的血清HBV DNA和ALT水平進(jìn)行了動態(tài)監(jiān)測,以比較兩種藥物對病毒抑制和肝功能恢復(fù)的療效。我們保留了全部血清樣本共200余份,并全部進(jìn)行了“PCR-直接測序”,以了解耐藥發(fā)生情況,并比較兩種藥物的耐藥發(fā)生率。我們進(jìn)一步采用國際認(rèn)可的“金標(biāo)準(zhǔn)”“PCR-克隆-測序-序列分析”的方法,對6例發(fā)生臨床病毒學(xué)突破的患者以及4例未發(fā)生臨床病毒學(xué)突破的患者(陰性對照)的全程血清樣本進(jìn)行了準(zhǔn)種檢測,共測序2100余個,以系統(tǒng)深入地對LAM和ETV治療過程中HBV種群的演變及其臨床意義進(jìn)行探討。最后,我們建立了適合于檢測包含所有目前已知的核苷類似物耐藥突變位點的P區(qū)目的片段準(zhǔn)種的研究方法,并對準(zhǔn)種檢測的方法學(xué)問題進(jìn)行了討論。 主要結(jié)果: 一、ETV和LAM對HBV DNA的抑制效果的中、長期比較:治療1年時ETV較LAM為佳(t=2.570, P=0.0180.05),而延長療程兩組無統(tǒng)計學(xué)差異(t60=1.570, P60=0.148; t72=1.432, P72=0.190; t96=1.663, P96=0.137)。ETV和LAM對肝功能改善的中、長期療效無統(tǒng)計學(xué)差異。尚須擴(kuò)大樣本量以確證這些研究結(jié)果。 二、ETV和LAM治療96周耐藥發(fā)生率比較:ETV顯著低于LAM(Pearsonχ2=6.490, P=0.0160.05)。 三、ETV初治患者和LAM預(yù)治療患者使用ETV后的耐藥發(fā)生率,初治患者顯著低于后者(Pearsonχ2=8.291, P=0.0360.05)。 四、發(fā)生臨床病毒學(xué)突破患者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種群發(fā)生了復(fù)雜而有規(guī)律的演變,未發(fā)生病毒學(xué)突破的患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種群則保持比較穩(wěn)定的狀態(tài)。耐藥毒株總是以劣勢株被藥物壓力篩選出來,并在準(zhǔn)種群中逐漸累積,最終代替原有優(yōu)勢準(zhǔn)種,并伴隨臨床病毒學(xué)突破和抗病毒治療的失敗。 五、體內(nèi)檢出耐藥毒株的患者均發(fā)生了臨床病毒學(xué)突破,而發(fā)生病毒學(xué)突破的患者則未必伴隨耐藥毒株的產(chǎn)生。 六、發(fā)現(xiàn)在HBV準(zhǔn)種群中曾經(jīng)出現(xiàn)的優(yōu)勢準(zhǔn)種在藥物壓力改變后可以劣勢準(zhǔn)種存在于準(zhǔn)種群中,并可進(jìn)一步演變?yōu)槎嗪塑疹愃莆锬退幎局辍?七、發(fā)現(xiàn)了未曾報道過的rtV190A耐ETV突變,該突變與已知的幾個突變聯(lián)合出現(xiàn)成為ETV治療過程中導(dǎo)致病毒學(xué)突破的耐藥突變株rtM204V/L180M/T184L/V190A。 八、發(fā)現(xiàn)LAM治療可在患者體內(nèi)篩選出rtM204V/L180M聯(lián)合突變株,這一突變株在LAM藥物壓力下較rtM204I突變株或rtM204I/L180M聯(lián)合突變株具有更強(qiáng)的復(fù)制能力和選擇優(yōu)勢,因此rtM204V/L180M聯(lián)合突變株和rtM204I或rtM204I/L180M聯(lián)合突變株的混合感染在發(fā)生病毒學(xué)突破時的優(yōu)勢株均為前者,我們稱其為“VM突破”。 九、LAM治療可在HBV準(zhǔn)種群中逐漸篩選出rtM204I/V突變、并可進(jìn)一步演變?yōu)榫哂懈邚?fù)制能力的rtM204V/L180M聯(lián)合突變,這一聯(lián)合突變株能在ETV治療過程中可以劣勢準(zhǔn)種的形式“記憶”于準(zhǔn)種群中,并可進(jìn)一步演變?yōu)閞tM204V/L180M/S202G、rtM204V/L180M/T184L、rtM204V/L180M/T184L/V190A等ETV耐藥聯(lián)合突變,因此,LAM-ETV序貫治療可分級攻克ETV具備的“基因屏障”,我們稱之為LAM-ETV序貫治療的“階梯效應(yīng)”。 十、發(fā)現(xiàn)在發(fā)生臨床病毒學(xué)突破12～72周前即可在患者體內(nèi)檢出以劣勢準(zhǔn)種存在的耐藥毒株,耐藥毒株在準(zhǔn)種群中的累積并替換原因野生型毒株需要一定的時間,這為我們進(jìn)行臨床準(zhǔn)種監(jiān)測提供了可行性。 十一、60個克隆測序后將測序結(jié)果隨機(jī)分為10、15、20……55個克隆共10組,χ2檢驗發(fā)現(xiàn)對于優(yōu)勢準(zhǔn)種的反映檢測15個克隆以上(χ2=2.700,P=0.1000.05),對劣勢株的檢出檢測30個以上則與檢測60個克隆無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=2.411,P=0.1200.05);比較8個樣本共270個克隆的CSGE及測序結(jié)果,兩者表現(xiàn)出良好的對應(yīng)性(準(zhǔn)確率達(dá)98.9%)。 通過對這些結(jié)果進(jìn)行分析并和既往研究結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)論如下: 一、ETV治療慢性乙型肝炎的耐藥發(fā)生率顯著低于LAM,長期治療更加安全; 二、HBV對核苷類似物耐藥的機(jī)制為:耐藥毒株在準(zhǔn)種群中被藥物壓力篩選、比例逐步升高并逐漸成為優(yōu)勢準(zhǔn)種,導(dǎo)致準(zhǔn)種群整體表現(xiàn)出對藥物的耐受性; 三、存在尚未報道的核苷類似物耐藥突變,這些突變可能存在于HBV基因組P基因rt區(qū)的B、C、D、E區(qū)域之外,并可與已知的耐藥突變聯(lián)合出現(xiàn)導(dǎo)致病毒耐藥或增強(qiáng)其耐藥能力。 四、LAM-ETV序貫治療可導(dǎo)致ETV的“基因屏障”失效,因此初治宜選用強(qiáng)效病毒抑制藥物如ETV,而不宜使用耐藥發(fā)生率高的藥物; 五、rtM204V/L180M聯(lián)合突變極易進(jìn)化為ETV耐藥突變,因此一旦在準(zhǔn)種群中檢出該突變,即不推薦使用ETV治療; 六、核苷類似物耐藥HBV準(zhǔn)種在病毒學(xué)突破前12～36周即可被檢出,因此有必要在臨床開展HBV準(zhǔn)種檢測并建立常規(guī)的實驗室檢測方法,在抗病毒治療過程中至少每3個月須作一次準(zhǔn)種檢測和準(zhǔn)種組成分析; 七、準(zhǔn)種檢測一旦發(fā)現(xiàn)耐藥準(zhǔn)種累積,須立即換用其它敏感藥物; 八、用“PCR-克隆-CSGE或SSCP/HDA-測序”的方法視不同需求檢測15或30個克隆可準(zhǔn)確反映1份血清樣本中HBV準(zhǔn)種的組成和分布。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

拉米夫定和恩替卡韋治療96周對HBVDNA的抑制效果比較

值離散較大，表明是以個別患者的ALT水平顯著升高為主，而大部分患者ALT升高不明顯；ETV治療組的平均ALT水平保持在較低水平。96周全程兩組患者的血清ALT水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖1-3)。圖 1-3 拉米夫定和恩替卡韋治療 96 周對肝功能的保護(hù)效果比較3. LAM和ETV治療與HBV耐藥17例接受LAM初始治療的患者中，在最初24周內(nèi)HBV DNA和ALT均迅速下降。在治療48周后即發(fā)現(xiàn)1例(1/17，5.9%)rtM204I突變(YIDD變異)，伴隨病毒學(xué)突破和生化學(xué)突破。隨著時間的推移，該組患者的平均HBV DNA和ALT水平有逐漸上升趨勢，同時相繼在該組患者體內(nèi)檢測到rtV173L、rtL180M及rtM204V/I(YV/IDD)等耐藥突變，這些突變的發(fā)生均伴隨該患者的病毒性突破，伴或不伴生化學(xué)突破。LAM治療48～96周是耐藥突變出現(xiàn)的高峰期

204V突變的患者有所減少，而rtM204I突變株及YMDD野生型毒株感染率有所上藥突變以rtM204I為主，平均HBV DNA和ALT水平有所下降，提示ETV對rtL180M204V耐藥突變株有較好的抑制作用，而對rtM204I突變株作用較弱。ETV治療36周組患者的平均HBV DNA和ALT有有逐漸升高趨勢。在72周ETV療程結(jié)束時，有2例又發(fā)生了病毒學(xué)突破，其中1例伴隨ALT升高，此時rtL180M及rtM204V耐藥突變株被檢出(14.3%，2/14)，其中1例患者攜帶了rtL180M/S202G/rtM204V突變株(圖1-4)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2808269