慢性乙型肝炎威脅全球人類健康,其中1/3以上的慢性感染者在中國(guó)�？共《局委熓锹砸倚透窝椎暮诵闹委煷胧�。核苷類似物是目前抗病毒治療的主流藥物,隨著眾多新型核苷類似物的研發(fā)和逐漸上市,臨床用藥有了更多選擇。其中恩替卡韋(ETV)作為強(qiáng)效HBV抑制藥物已于近年上市,但目前尚缺乏對(duì)ETV長(zhǎng)期治療的臨床觀察,及其與現(xiàn)有的主流核苷類似物如拉米夫定(LAM)長(zhǎng)期療效對(duì)比的對(duì)照研究。 同時(shí),這些核苷類似物在使用過(guò)程中遇到一系列難以回答的問(wèn)題,諸如:①初治患者應(yīng)如何選擇核苷類抗病毒藥物;②核苷類似物耐藥的預(yù)防和處理;③核苷類似物可否聯(lián)合、序貫使用,如何使用;④停藥時(shí)機(jī)的把握等。我們注意到,核苷類似物的耐藥問(wèn)題是上述問(wèn)題的核心。目前核苷類似物的使用也主要把握兩點(diǎn):一是充分發(fā)揮藥物的抗病毒功效,另一方面則是盡量避免耐藥的發(fā)生。然而目前臨床使用核苷類抗病毒藥物缺乏必要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù),同時(shí)對(duì)治療過(guò)程中病毒變異的分子病毒學(xué)過(guò)程和耐藥發(fā)生機(jī)制缺乏深入的了解,這是制約核苷類似物科學(xué)合理使用的關(guān)鍵問(wèn)題。 準(zhǔn)種概念的引入為我們客觀認(rèn)識(shí)高變異病毒在宿主免疫和藥物等壓力下的運(yùn)動(dòng)規(guī)律提供了新的切入點(diǎn)。對(duì)HCV、HIV等高變異病毒的準(zhǔn)種研究發(fā)現(xiàn),這些病毒以種群選擇優(yōu)勢(shì)對(duì)抗環(huán)境壓力的改變,使種群得以延續(xù)。它們?cè)谒拗黧w內(nèi)以多變異株的形式混合存在,在一定的外界壓力下以某一或某些對(duì)當(dāng)前壓力具有選擇優(yōu)勢(shì)的變異株為優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種,且準(zhǔn)種群可隨著外界壓力的改變而發(fā)生演變以進(jìn)一步適應(yīng)環(huán)境。最近的研究發(fā)現(xiàn),HBV種群在核苷類似物治療過(guò)程中也可發(fā)生類似演變,且與HBV耐藥和抗病毒治療失敗密切相關(guān)。但由于均為個(gè)案研究,雖然為進(jìn)一步的研究提供了線索,但仍對(duì)這一問(wèn)題缺乏系統(tǒng)深入的理解。同時(shí),目前的研究方法仍以“PCR-克隆-測(cè)序”為“金標(biāo)準(zhǔn)”,尚缺乏對(duì)HBV準(zhǔn)種進(jìn)行精確、簡(jiǎn)便檢測(cè)和篩選的研究方法。 為探討上述問(wèn)題,本研究選擇了36例接受ETV或LAM治療的慢性乙型肝炎患者進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)192周的隨訪觀察,其中17例LAM初治患者有14例接受了后續(xù)ETV序貫治療。我們對(duì)不同藥物治療的兩組患者的血清HBV DNA和ALT水平進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),以比較兩種藥物對(duì)病毒抑制和肝功能恢復(fù)的療效。我們保留了全部血清樣本共200余份,并全部進(jìn)行了“PCR-直接測(cè)序”,以了解耐藥發(fā)生情況,并比較兩種藥物的耐藥發(fā)生率。我們進(jìn)一步采用國(guó)際認(rèn)可的“金標(biāo)準(zhǔn)”“PCR-克隆-測(cè)序-序列分析”的方法,對(duì)6例發(fā)生臨床病毒學(xué)突破的患者以及4例未發(fā)生臨床病毒學(xué)突破的患者(陰性對(duì)照)的全程血清樣本進(jìn)行了準(zhǔn)種檢測(cè),共測(cè)序2100余個(gè),以系統(tǒng)深入地對(duì)LAM和ETV治療過(guò)程中HBV種群的演變及其臨床意義進(jìn)行探討。最后,我們建立了適合于檢測(cè)包含所有目前已知的核苷類似物耐藥突變位點(diǎn)的P區(qū)目的片段準(zhǔn)種的研究方法,并對(duì)準(zhǔn)種檢測(cè)的方法學(xué)問(wèn)題進(jìn)行了討論。 主要結(jié)果: 一、ETV和LAM對(duì)HBV DNA的抑制效果的中、長(zhǎng)期比較:治療1年時(shí)ETV較LAM為佳(t=2.570, P=0.0180.05),而延長(zhǎng)療程兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t60=1.570, P60=0.148; t72=1.432, P72=0.190; t96=1.663, P96=0.137)。ETV和LAM對(duì)肝功能改善的中、長(zhǎng)期療效無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。尚須擴(kuò)大樣本量以確證這些研究結(jié)果。 二、ETV和LAM治療96周耐藥發(fā)生率比較:ETV顯著低于LAM(Pearsonχ2=6.490, P=0.0160.05)。 三、ETV初治患者和LAM預(yù)治療患者使用ETV后的耐藥發(fā)生率,初治患者顯著低于后者(Pearsonχ2=8.291, P=0.0360.05)。 四、發(fā)生臨床病毒學(xué)突破患者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種群發(fā)生了復(fù)雜而有規(guī)律的演變,未發(fā)生病毒學(xué)突破的患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種群則保持比較穩(wěn)定的狀態(tài)。耐藥毒株總是以劣勢(shì)株被藥物壓力篩選出來(lái),并在準(zhǔn)種群中逐漸累積,最終代替原有優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種,并伴隨臨床病毒學(xué)突破和抗病毒治療的失敗。 五、體內(nèi)檢出耐藥毒株的患者均發(fā)生了臨床病毒學(xué)突破,而發(fā)生病毒學(xué)突破的患者則未必伴隨耐藥毒株的產(chǎn)生。 六、發(fā)現(xiàn)在HBV準(zhǔn)種群中曾經(jīng)出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種在藥物壓力改變后可以劣勢(shì)準(zhǔn)種存在于準(zhǔn)種群中,并可進(jìn)一步演變?yōu)槎嗪塑疹愃莆锬退幎局辍?七、發(fā)現(xiàn)了未曾報(bào)道過(guò)的rtV190A耐ETV突變,該突變與已知的幾個(gè)突變聯(lián)合出現(xiàn)成為ETV治療過(guò)程中導(dǎo)致病毒學(xué)突破的耐藥突變株rtM204V/L180M/T184L/V190A。 八、發(fā)現(xiàn)LAM治療可在患者體內(nèi)篩選出rtM204V/L180M聯(lián)合突變株,這一突變株在LAM藥物壓力下較rtM204I突變株或rtM204I/L180M聯(lián)合突變株具有更強(qiáng)的復(fù)制能力和選擇優(yōu)勢(shì),因此rtM204V/L180M聯(lián)合突變株和rtM204I或rtM204I/L180M聯(lián)合突變株的混合感染在發(fā)生病毒學(xué)突破時(shí)的優(yōu)勢(shì)株均為前者,我們稱其為“VM突破”。 九、LAM治療可在HBV準(zhǔn)種群中逐漸篩選出rtM204I/V突變、并可進(jìn)一步演變?yōu)榫哂懈邚?fù)制能力的rtM204V/L180M聯(lián)合突變,這一聯(lián)合突變株能在ETV治療過(guò)程中可以劣勢(shì)準(zhǔn)種的形式“記憶”于準(zhǔn)種群中,并可進(jìn)一步演變?yōu)閞tM204V/L180M/S202G、rtM204V/L180M/T184L、rtM204V/L180M/T184L/V190A等ETV耐藥聯(lián)合突變,因此,LAM-ETV序貫治療可分級(jí)攻克ETV具備的“基因屏障”,我們稱之為L(zhǎng)AM-ETV序貫治療的“階梯效應(yīng)”。 十、發(fā)現(xiàn)在發(fā)生臨床病毒學(xué)突破12～72周前即可在患者體內(nèi)檢出以劣勢(shì)準(zhǔn)種存在的耐藥毒株,耐藥毒株在準(zhǔn)種群中的累積并替換原因野生型毒株需要一定的時(shí)間,這為我們進(jìn)行臨床準(zhǔn)種監(jiān)測(cè)提供了可行性。 十一、60個(gè)克隆測(cè)序后將測(cè)序結(jié)果隨機(jī)分為10、15、20……55個(gè)克隆共10組,χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)于優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種的反映檢測(cè)15個(gè)克隆以上(χ2=2.700,P=0.1000.05),對(duì)劣勢(shì)株的檢出檢測(cè)30個(gè)以上則與檢測(cè)60個(gè)克隆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.411,P=0.1200.05);比較8個(gè)樣本共270個(gè)克隆的CSGE及測(cè)序結(jié)果,兩者表現(xiàn)出良好的對(duì)應(yīng)性(準(zhǔn)確率達(dá)98.9%)。 通過(guò)對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行分析并和既往研究結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)論如下: 一、ETV治療慢性乙型肝炎的耐藥發(fā)生率顯著低于LAM,長(zhǎng)期治療更加安全; 二、HBV對(duì)核苷類似物耐藥的機(jī)制為:耐藥毒株在準(zhǔn)種群中被藥物壓力篩選、比例逐步升高并逐漸成為優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種,導(dǎo)致準(zhǔn)種群整體表現(xiàn)出對(duì)藥物的耐受性; 三、存在尚未報(bào)道的核苷類似物耐藥突變,這些突變可能存在于HBV基因組P基因rt區(qū)的B、C、D、E區(qū)域之外,并可與已知的耐藥突變聯(lián)合出現(xiàn)導(dǎo)致病毒耐藥或增強(qiáng)其耐藥能力。 四、LAM-ETV序貫治療可導(dǎo)致ETV的“基因屏障”失效,因此初治宜選用強(qiáng)效病毒抑制藥物如ETV,而不宜使用耐藥發(fā)生率高的藥物; 五、rtM204V/L180M聯(lián)合突變極易進(jìn)化為ETV耐藥突變,因此一旦在準(zhǔn)種群中檢出該突變,即不推薦使用ETV治療; 六、核苷類似物耐藥HBV準(zhǔn)種在病毒學(xué)突破前12～36周即可被檢出,因此有必要在臨床開(kāi)展HBV準(zhǔn)種檢測(cè)并建立常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,在抗病毒治療過(guò)程中至少每3個(gè)月須作一次準(zhǔn)種檢測(cè)和準(zhǔn)種組成分析; 七、準(zhǔn)種檢測(cè)一旦發(fā)現(xiàn)耐藥準(zhǔn)種累積,須立即換用其它敏感藥物; 八、用“PCR-克隆-CSGE或SSCP/HDA-測(cè)序”的方法視不同需求檢測(cè)15或30個(gè)克隆可準(zhǔn)確反映1份血清樣本中HBV準(zhǔn)種的組成和分布。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

拉米夫定和恩替卡韋治療96周對(duì)HBVDNA的抑制效果比較

值離散較大，表明是以個(gè)別患者的ALT水平顯著升高為主，而大部分患者ALT升高不明顯；ETV治療組的平均ALT水平保持在較低水平。96周全程兩組患者的血清ALT水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1-3)。圖 1-3 拉米夫定和恩替卡韋治療 96 周對(duì)肝功能的保護(hù)效果比較3. LAM和ETV治療與HBV耐藥17例接受LAM初始治療的患者中，在最初24周內(nèi)HBV DNA和ALT均迅速下降。在治療48周后即發(fā)現(xiàn)1例(1/17，5.9%)rtM204I突變(YIDD變異)，伴隨病毒學(xué)突破和生化學(xué)突破。隨著時(shí)間的推移，該組患者的平均HBV DNA和ALT水平有逐漸上升趨勢(shì)，同時(shí)相繼在該組患者體內(nèi)檢測(cè)到rtV173L、rtL180M及rtM204V/I(YV/IDD)等耐藥突變，這些突變的發(fā)生均伴隨該患者的病毒性突破，伴或不伴生化學(xué)突破。LAM治療48～96周是耐藥突變出現(xiàn)的高峰期

204V突變的患者有所減少，而rtM204I突變株及YMDD野生型毒株感染率有所上藥突變以rtM204I為主，平均HBV DNA和ALT水平有所下降，提示ETV對(duì)rtL180M204V耐藥突變株有較好的抑制作用，而對(duì)rtM204I突變株作用較弱。ETV治療36周組患者的平均HBV DNA和ALT有有逐漸升高趨勢(shì)。在72周ETV療程結(jié)束時(shí)，有2例又發(fā)生了病毒學(xué)突破，其中1例伴隨ALT升高，此時(shí)rtL180M及rtM204V耐藥突變株被檢出(14.3%，2/14)，其中1例患者攜帶了rtL180M/S202G/rtM204V突變株(圖1-4)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 成軍;乙型肝炎病毒基因異質(zhì)性及準(zhǔn)種特點(diǎn)研究的臨床意義[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2002年02期

2 蘭林,王宇明;構(gòu)象敏感凝膠電泳快速檢測(cè)HBV準(zhǔn)種序列異質(zhì)性的方法[J];世界華人消化雜志;2002年04期

3 蘭林;王宇明;;乙型肝炎病毒準(zhǔn)種異質(zhì)性對(duì)干擾素應(yīng)答性的影響[J];世界華人消化雜志;2003年02期

4 蘭林,王宇明,黃燕萍;慢性乙型肝炎患者病毒準(zhǔn)種特性的初步研究[J];中華肝臟病雜志;2003年04期

5 劉霖;王宇明;蘭林;李俊剛;鄧國(guó)宏;夏杰;趙學(xué)蘭;張緒清;;慢性乙型肝炎急性發(fā)作患者血清病毒準(zhǔn)種動(dòng)力學(xué)研究[J];中華肝臟病雜志;2006年01期

6 董菁,成軍,王勤環(huán),皇甫競(jìng)坤,施雙雙,張國(guó)慶,洪源,李莉,斯崇文;慢性乙型肝炎患者體內(nèi)乙型肝炎病毒DNA序列異質(zhì)性及準(zhǔn)種特點(diǎn)的研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2002年02期

本文編號(hào)：2808269