非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已經(jīng)成為一種常見的慢性肝病,其發(fā)病率逐年上升。它包括單純性脂肪肝(simple steatosis,SS)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纖維化和肝硬化。脂肪肝是一種良性疾病,而NASH卻可進(jìn)一步發(fā)展、惡化成為終末期肝病,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。目前NAFLD的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至今仍尚不清楚,認(rèn)為與氧化應(yīng)激的增加、線粒體損傷和脂肪因子等因素相關(guān),但對(duì)導(dǎo)致進(jìn)行性肝細(xì)胞損傷的機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門研究機(jī)體特定條件下功能狀態(tài)的前沿技術(shù),更貼近機(jī)體已經(jīng)或正在發(fā)生的行為和功能狀態(tài),可為疾病診斷和治療提供大量的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),肝活檢是一種損傷性的檢測(cè)方法,而且取得的肝組織樣本也不足于大規(guī)模的篩選差異蛋白質(zhì)。因此,本研究以蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine and cholinedeficient,MCD)飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型為研究對(duì)象,采用差異凝膠電泳(dimensional difference gel electrophoresis,DIGE)技術(shù)篩選出與NAFLD密切相關(guān)的肝臟差異蛋白質(zhì)譜,結(jié)合生物信息學(xué)手段系統(tǒng)的分析了差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并篩選出重要的節(jié)點(diǎn)分子進(jìn)行了驗(yàn)證,從而為深入探討NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)本研究還采用血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析(serological proteomeanalysis,SERPA)技術(shù)篩選出與NAFLD密切相關(guān)的自身抗原譜,為挖掘NAFLD潛在的血清標(biāo)志物而提供了理論依據(jù)。 我們分別用正常飲食與MCD飲食飼養(yǎng)小鼠,并在MCD飼養(yǎng)后的2、5、8周,成功復(fù)制出不同病變程度的NAFLD動(dòng)物模型(單純性脂肪肝(SS),脂肪性肝炎(NASH)及NASH伴早期肝纖維化。我們采用DIGE技術(shù)分析了不同造模時(shí)間的正常組和模型組小鼠肝臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異,并用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的檢測(cè),共鑒定了189個(gè)差異蛋白。其中SS階段的差異蛋白58個(gè),NASH階段的差異蛋白82個(gè),NASH伴早期肝纖維化階段的差異蛋白162個(gè)。這些差異蛋白多數(shù)存在于線粒體(52.2%),其次為細(xì)胞外區(qū)域(13.4%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(10.4%)、細(xì)胞漿(9.0%)、細(xì)胞核(9.0%)、過氧化物酶體(4.5%)和未知定位(1.5%)。通過差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析,我們發(fā)現(xiàn)隨著NAFLD病程的進(jìn)展,參與清除氧自由基相關(guān)酶、脂肪酸β氧化的相關(guān)酶及糖異生相關(guān)酶的表達(dá)逐漸降低,而脂肪形成相關(guān)酶和細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)逐漸升高。同時(shí),在NASH伴早期肝纖維化階段,星狀細(xì)胞標(biāo)志蛋白結(jié)蛋白(desmin)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá)明顯增加,表明NAFLD病程向肝纖維化進(jìn)一步惡化。 最為顯著的是脂肪代謝紊亂始終貫穿NAFLD的發(fā)生發(fā)展,特別是對(duì)NASH伴早期肝纖維化階段差異蛋白的IPA分析,我們發(fā)現(xiàn)兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活,分別是Akt/PKB通路和p38MAPK通路。首先,我們?cè)贜AFLD模型中,從蛋白水平和mRNA水平驗(yàn)證了DIGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性;其次,采用Western blot技術(shù)檢測(cè)到NASH伴早期肝纖維化階段肝組織pho-Akt和pho-p38的表達(dá)明顯增加。內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)作為一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子,通過模擬胰島素樣作用和加重炎癥反應(yīng)得到人們的廣泛關(guān)注。因此,我們采用免疫組化技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),檢測(cè)到Visfatin不僅在NASH伴早期肝纖維化肝組織中表達(dá)明顯增加,而且在其血清中也明顯增高,因此我們認(rèn)為Visfatin通過激活A(yù)kt/PKB和p38MAPK通路,加重肝細(xì)胞內(nèi)TG的蓄積和肝組織炎癥反應(yīng),從而在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。 與此同時(shí),我們又采用SERPA技術(shù)篩選出18個(gè)與NAFLD發(fā)展密切相關(guān)的自身抗原,通過對(duì)自身抗原α-烯醇酶(α-enolase,ENOA)和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶3(Protein disulfide isomerase associated 3,PDI3)的驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)抗原的形成與其在疾病狀態(tài)下表達(dá)量的高低沒有明顯的關(guān)系。而且,我們進(jìn)一步證實(shí)了NAFLD患者血清中存在抗ENOA抗體,并且抗體滴度的高低與肝細(xì)胞的損傷程度正相關(guān)。因此,本研究在蛋白整體水平挖掘了與NAFLD密切相關(guān)的自身抗原譜,為篩選潛在的NAFLD分期分型的診斷標(biāo)志物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖INAFLD發(fā)病機(jī)制的“二次打擊”學(xué)說(shuō)和常用的動(dòng)物模型’2首先，肝臟在糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝中起到關(guān)鍵的核心作用，特別是吸納游離脂肪酸，產(chǎn)生、儲(chǔ)存和分泌脂類物質(zhì)以及脂蛋白。因此，肝細(xì)胞內(nèi)甘油三醋累積是NAFLD的發(fā)生發(fā)展的一個(gè)必須條件’6。然而，、恤maguchil’等認(rèn)為甘油三醋具有降低游離脂肪酸肝毒性的作用，清除TG可能會(huì)加重肝臟炎癥反應(yīng)。其次，IR導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪累積的機(jī)制主要包括肝外脂肪分解的增加和高胰島素血癥’8。肝外脂肪分解增加、脂肪組織對(duì)餐后游離脂肪酸的攝取和儲(chǔ)存減少，導(dǎo)致過多的游離脂肪酸涌入肝臟，而胰島素分泌過多可進(jìn)一步促進(jìn)血清游離脂肪酸的升高，直接造成肝毒性。此外，胰島素分泌過多還可以通過調(diào)控脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterolregulato叮elementbindingprotein一l，S既BP一l)、碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrateresponseelementbindingprotein，ChREBP)促進(jìn)肝臟脂肪形成’9一。然而，IR并不能解釋所有的NAFLD的發(fā)病機(jī)制，

圖2脂肪分泌的脂肪因子23(interieukin，IL一6)等細(xì)胞因子，這些脂肪細(xì)胞因子均參與肥胖相關(guān)的炎癥反應(yīng)。(見圖2)23。有研究報(bào)道NASH患者會(huì)出現(xiàn)高瘦素血癥和瘦素抵抗，從而抑制胰島素分泌的作用減弱，出現(xiàn)高胰島素血癥，其又可增加脂肪組織瘦素基因的表達(dá)，加劇瘦素抵抗24。但有人發(fā)現(xiàn)，瘦素水平與胰島素抵抗無(wú)明顯關(guān)系2，。高瘦素血癥可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF一a、IL一6、IL一12等細(xì)胞因子，激活肝星狀細(xì)胞，也可以使肝臟KuPffer細(xì)胞及竇內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并且可能激活JAK一STAT信號(hào)通路，刺激肝臟星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)肝纖維化發(fā)展26。NAsH患者血清瘦素含量升高

與同期對(duì)照組相比，模型組小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清ALT、AST水平均顯著升高(P<0.05);此外，造模8周后，血清ALT、AST較造模5周時(shí)明顯增高(P<0.ol)(圖1.3A，1.3B)。與對(duì)照組相比，模型2、5周組血清TG和TC明顯下降(P<0.ol)，然后逐漸上升，但造模8周時(shí)TC仍然低于對(duì)照組(P<0.05)(圖 1.3C)，而TG高于對(duì)照組(圖1.3D)。與對(duì)照組相比，模型組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清Glu均顯著下降(尸 <0.05)(圖 1.3E)o

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