非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已經(jīng)成為一種常見的慢性肝病,其發(fā)病率逐年上升。它包括單純性脂肪肝(simple steatosis,SS)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纖維化和肝硬化。脂肪肝是一種良性疾病,而NASH卻可進一步發(fā)展、惡化成為終末期肝病,嚴重者可導致死亡。目前NAFLD的發(fā)生發(fā)展機制至今仍尚不清楚,認為與氧化應激的增加、線粒體損傷和脂肪因子等因素相關(guān),但對導致進行性肝細胞損傷的機制有待于進一步探討。蛋白質(zhì)組學是一門研究機體特定條件下功能狀態(tài)的前沿技術(shù),更貼近機體已經(jīng)或正在發(fā)生的行為和功能狀態(tài),可為疾病診斷和治療提供大量的理論和實驗依據(jù)。同時,肝活檢是一種損傷性的檢測方法,而且取得的肝組織樣本也不足于大規(guī)模的篩選差異蛋白質(zhì)。因此,本研究以蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine and cholinedeficient,MCD)飲食誘導的NAFLD小鼠模型為研究對象,采用差異凝膠電泳(dimensional difference gel electrophoresis,DIGE)技術(shù)篩選出與NAFLD密切相關(guān)的肝臟差異蛋白質(zhì)譜,結(jié)合生物信息學手段系統(tǒng)的分析了差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡,并篩選出重要的節(jié)點分子進行了驗證,從而為深入探討NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定了基礎。同時本研究還采用血清蛋白質(zhì)組學分析(serological proteomeanalysis,SERPA)技術(shù)篩選出與NAFLD密切相關(guān)的自身抗原譜,為挖掘NAFLD潛在的血清標志物而提供了理論依據(jù)。 我們分別用正常飲食與MCD飲食飼養(yǎng)小鼠,并在MCD飼養(yǎng)后的2、5、8周,成功復制出不同病變程度的NAFLD動物模型(單純性脂肪肝(SS),脂肪性肝炎(NASH)及NASH伴早期肝纖維化。我們采用DIGE技術(shù)分析了不同造模時間的正常組和模型組小鼠肝臟蛋白質(zhì)表達譜的差異,并用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進行差異蛋白質(zhì)的檢測,共鑒定了189個差異蛋白。其中SS階段的差異蛋白58個,NASH階段的差異蛋白82個,NASH伴早期肝纖維化階段的差異蛋白162個。這些差異蛋白多數(shù)存在于線粒體(52.2%),其次為細胞外區(qū)域(13.4%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(10.4%)、細胞漿(9.0%)、細胞核(9.0%)、過氧化物酶體(4.5%)和未知定位(1.5%)。通過差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡分析,我們發(fā)現(xiàn)隨著NAFLD病程的進展,參與清除氧自由基相關(guān)酶、脂肪酸β氧化的相關(guān)酶及糖異生相關(guān)酶的表達逐漸降低,而脂肪形成相關(guān)酶和細胞骨架蛋白的表達逐漸升高。同時,在NASH伴早期肝纖維化階段,星狀細胞標志蛋白結(jié)蛋白(desmin)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein,GFAP)的表達明顯增加,表明NAFLD病程向肝纖維化進一步惡化。 最為顯著的是脂肪代謝紊亂始終貫穿NAFLD的發(fā)生發(fā)展,特別是對NASH伴早期肝纖維化階段差異蛋白的IPA分析,我們發(fā)現(xiàn)兩條信號轉(zhuǎn)導通路被激活,分別是Akt/PKB通路和p38MAPK通路。首先,我們在NAFLD模型中,從蛋白水平和mRNA水平驗證了DIGE實驗結(jié)果的可靠性;其次,采用Western blot技術(shù)檢測到NASH伴早期肝纖維化階段肝組織pho-Akt和pho-p38的表達明顯增加。內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)作為一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子,通過模擬胰島素樣作用和加重炎癥反應得到人們的廣泛關(guān)注。因此,我們采用免疫組化技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗,檢測到Visfatin不僅在NASH伴早期肝纖維化肝組織中表達明顯增加,而且在其血清中也明顯增高,因此我們認為Visfatin通過激活Akt/PKB和p38MAPK通路,加重肝細胞內(nèi)TG的蓄積和肝組織炎癥反應,從而在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。 與此同時,我們又采用SERPA技術(shù)篩選出18個與NAFLD發(fā)展密切相關(guān)的自身抗原,通過對自身抗原α-烯醇酶(α-enolase,ENOA)和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶3(Protein disulfide isomerase associated 3,PDI3)的驗證,我們發(fā)現(xiàn)抗原的形成與其在疾病狀態(tài)下表達量的高低沒有明顯的關(guān)系。而且,我們進一步證實了NAFLD患者血清中存在抗ENOA抗體,并且抗體滴度的高低與肝細胞的損傷程度正相關(guān)。因此,本研究在蛋白整體水平挖掘了與NAFLD密切相關(guān)的自身抗原譜,為篩選潛在的NAFLD分期分型的診斷標志物提供了實驗基礎。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖INAFLD發(fā)病機制的“二次打擊”學說和常用的動物模型’2首先，肝臟在糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝中起到關(guān)鍵的核心作用，特別是吸納游離脂肪酸，產(chǎn)生、儲存和分泌脂類物質(zhì)以及脂蛋白。因此，肝細胞內(nèi)甘油三醋累積是NAFLD的發(fā)生發(fā)展的一個必須條件’6。然而，、恤maguchil’等認為甘油三醋具有降低游離脂肪酸肝毒性的作用，清除TG可能會加重肝臟炎癥反應。其次，IR導致肝細胞內(nèi)脂肪累積的機制主要包括肝外脂肪分解的增加和高胰島素血癥’8。肝外脂肪分解增加、脂肪組織對餐后游離脂肪酸的攝取和儲存減少，導致過多的游離脂肪酸涌入肝臟，而胰島素分泌過多可進一步促進血清游離脂肪酸的升高，直接造成肝毒性。此外，胰島素分泌過多還可以通過調(diào)控脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterolregulato叮elementbindingprotein一l，S既BP一l)、碳水化合物反應元件結(jié)合蛋白(carbohydrateresponseelementbindingprotein，ChREBP)促進肝臟脂肪形成’9一。然而，IR并不能解釋所有的NAFLD的發(fā)病機制，

圖2脂肪分泌的脂肪因子23(interieukin，IL一6)等細胞因子，這些脂肪細胞因子均參與肥胖相關(guān)的炎癥反應。(見圖2)23。有研究報道NASH患者會出現(xiàn)高瘦素血癥和瘦素抵抗，從而抑制胰島素分泌的作用減弱，出現(xiàn)高胰島素血癥，其又可增加脂肪組織瘦素基因的表達，加劇瘦素抵抗24。但有人發(fā)現(xiàn)，瘦素水平與胰島素抵抗無明顯關(guān)系2，。高瘦素血癥可以促進巨噬細胞分泌TNF一a、IL一6、IL一12等細胞因子，激活肝星狀細胞，也可以使肝臟KuPffer細胞及竇內(nèi)皮細胞產(chǎn)生氧化應激，并且可能激活JAK一STAT信號通路，刺激肝臟星狀細胞活化，促進肝纖維化發(fā)展26。NAsH患者血清瘦素含量升高

與同期對照組相比，模型組小鼠各個時間點血清ALT、AST水平均顯著升高(P<0.05);此外，造模8周后，血清ALT、AST較造模5周時明顯增高(P<0.ol)(圖1.3A，1.3B)。與對照組相比，模型2、5周組血清TG和TC明顯下降(P<0.ol)，然后逐漸上升，但造模8周時TC仍然低于對照組(P<0.05)(圖 1.3C)，而TG高于對照組(圖1.3D)。與對照組相比，模型組小鼠各時間點血清Glu均顯著下降(尸 <0.05)(圖 1.3E)o

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4 張雷;王s

本文編號：2807854