【摘要】：研究目的和意義 載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzymecatalytic-polypeptide，APOBEC)家族，是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抗病毒作用的天然免疫分子，可通過DNA編輯、RNA編輯以及非編輯途徑對HIV和HBV等多種病毒進(jìn)行抑制。其中A3F和A3G可通過多種途徑抑制HBV的復(fù)制，其通過與HBcAg的相互作用，抑制HBV前體RNA的包裝，通過非編輯途徑發(fā)揮病毒抑制功能；亦可通過編輯途徑對HBV基因組超突變。但目前尚有一些機(jī)制仍不明確，A3F和A3G與HBcAg的相互作用是直接的蛋白結(jié)合還是經(jīng)細(xì)胞內(nèi)其它蛋白介導(dǎo)結(jié)合；A3F和A3G的亞細(xì)胞定位與其不同途徑抑制病毒復(fù)制的功能之間的聯(lián)系等。為此，本研究通過對A3F和A3G進(jìn)行克隆、表達(dá)、亞細(xì)胞定位分析以及與乙肝核心抗原相互作用進(jìn)行研究，以期揭示A3F和A3G抑制HBV的部分待解決的疑問。 材料和方法 1.提取經(jīng)PHA刺激的人外周血單個核細(xì)胞的RNA，RT-PCR克隆人A3F和A3G的cDNA，并構(gòu)建其酵母雙雜交表達(dá)載體pGADT7-3G/-3F；PCR克隆HBV ayw亞型核心抗原HBcAg基因，構(gòu)建其酵母雙雜交表達(dá)載體pGBKT7-HBcAg。 2.排除自激活效應(yīng)后，將構(gòu)建的載體pGBKT7-HBcAg分別與pGADT7-3G和pGADT7-3F共轉(zhuǎn)化到AH109酵母菌，利用營養(yǎng)二缺平板及四缺平板培養(yǎng)、α-半乳糖苷酶活性測試，檢測HBcAg與A3F和A3G的直接相互作用。 3.構(gòu)建含有HBcAg、人A3F和A3G基因的多種標(biāo)簽融合真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀回收產(chǎn)物的Western blotting檢測。 4.人A3F和A3G的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，間接免疫熒光檢測人A3F和A3G的亞細(xì)胞定位。 5.構(gòu)建含有核定位信號的綠色熒光蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，觀察核定位信號的定位功能；并將人A3F和A3G與上述經(jīng)功能驗(yàn)證具有核定位功能的核定位信號融合表達(dá)，免疫熒光觀察人A3F和A3G是否發(fā)生轉(zhuǎn)位。 結(jié)果及結(jié)論 1.酶切及DNA測序分析表明成功克隆HBcAg、人A3F和A3G，并成功構(gòu)建酵母雙雜交、免疫共沉淀、真核表達(dá)及亞細(xì)胞定位相關(guān)的表達(dá)質(zhì)粒。 2.通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)對α-半乳糖苷酶定性和定量檢測顯示，A3F和A3G蛋白均與HBcAg蛋白可能不存在相互作用亦或是并不發(fā)生直接的相互作用，而是可能通過某個蛋白的介導(dǎo)而發(fā)生間接相互作用。 3.將構(gòu)建好的pcFlag-3F、pcFlag -3G、pcMyc-HBcAg質(zhì)粒分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48hr后通過Western blot顯示A3F和A3G蛋白和HBcAg蛋白在HeLa細(xì)胞中均能很好表達(dá)；進(jìn)一步將轉(zhuǎn)染48hr后的HeLa細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示A3F/A3G蛋白和HBcAg蛋白均能被沉淀下來，而蛋白量有所下降。 4.在熒光顯微鏡下觀察顯示A3F和A3G重組蛋白呈密集點(diǎn)狀主要分布在細(xì)胞胞漿，而胞核位置無明顯熒光信號。表明A3F和A3G蛋白主要定位于細(xì)胞胞漿。 5.熒光觀察顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-C1對照載體的MDCK細(xì)胞，其GFP彌散分布在細(xì)胞中，而與BNLS及MNLS融合表達(dá)的GFP主要分布于細(xì)胞核中。表明，BNLS和MNLS均顯示核定位生物學(xué)活性。 6.熒光觀察顯示MNLS及BNLS融合表達(dá)的A3F和A3G，仍然主要分布在細(xì)胞胞漿中。上述結(jié)果表明，可以有效引導(dǎo)GFP進(jìn)入細(xì)胞核的MNLS及BNLS，不能將A3F和A3G有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，推測A3F和A3G中可能存在更強(qiáng)的胞漿定位信號或與其他胞漿蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62
【圖文】：

圖 1 -1 ： HB V 病毒 顆粒 和 基因 組成 [1 ]F i g1 - 1. HB V vi ro n an d ge n o mi c o ri gn i za t i on 前 ， 對 于 HB V 生 活 周 期 的 最 早 步 驟 （ 如 病 毒 結(jié) 合 和 穿 入 ） 了 解 的 還 極 其 有 為 HB V 由 羧 肽 酶 家 族 中 一 個 大 小 為 1 80 k Da 的 宿 主 蛋 白 介 導(dǎo) 結(jié) 合 肝 細(xì) 胞 ， 并 在 肝 細(xì) 胞 質(zhì) 中 釋 放 核 衣殼 ， 裸 露 的 病 毒 核 酸 進(jìn) 入 細(xì) 胞 核 ， 經(jīng) DN A 聚 合 酶 ， 轉(zhuǎn) 為 完 整 雙 鏈 開 環(huán) DN A ， 隨 后 形 成 雙 鏈 螺 旋 閉 環(huán) DN A 即 cc c DN A ， cc c NA 聚合 酶 Ⅱ作 用 下轉(zhuǎn) 錄 成次 基因 組 R NA （其 中包 括 前基 因 組 R NA ） ，相關(guān) 病 翻譯 成病 毒 膜蛋 白、 核 心蛋 白、 D N A 聚合 酶 和 X 蛋 白， 前 基 因 組 P gR NA 則 包 裝 入 核 心 顆 粒 ， 經(jīng) 逆 轉(zhuǎn) 錄 開 始 合 成 負(fù) 鏈 DN A ， 再 以 負(fù) 鏈 DN A 為 模 板 合 當(dāng) 病毒 DN A 鏈合 成時 ， 核心 顆 粒 進(jìn) 入內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng)中 的高 爾 基體 獲得 糖 蛋白 包膜 放 （見 圖 1- 2 ） [ 1] 。

圖 1 -1 ： HB V 病毒 顆粒 和 基因 組成 [1 ]F i g1 - 1. HB V vi ro n an d ge n o mi c o ri gn i za t i on 前 ， 對 于 HB V 生 活 周 期 的 最 早 步 驟 （ 如 病 毒 結(jié) 合 和 穿 入 ） 了 解 的 還 極 其 有 為 HB V 由 羧 肽 酶 家 族 中 一 個 大 小 為 1 80 k Da 的 宿 主 蛋 白 介 導(dǎo) 結(jié) 合 肝 細(xì) 胞 ， 并 在 肝 細(xì) 胞 質(zhì) 中 釋 放 核 衣殼 ， 裸 露 的 病 毒 核 酸 進(jìn) 入 細(xì) 胞 核 ， 經(jīng) DN A 聚 合 酶 ， 轉(zhuǎn) 為 完 整 雙 鏈 開 環(huán) DN A ， 隨 后 形 成 雙 鏈 螺 旋 閉 環(huán) DN A 即 cc c DN A ， cc NA 聚合 酶 Ⅱ作 用 下轉(zhuǎn) 錄 成次 基因 組 R NA （其 中包 括 前基 因 組 R NA ） ，相關(guān) 病 翻譯 成病 毒 膜蛋 白、 核 心蛋 白、 D N A 聚合 酶 和 X 蛋 白， 前 基 因 組 P gR NA 則 包 裝 入 核 心 顆 粒 ， 經(jīng) 逆 轉(zhuǎn) 錄 開 始 合 成 負(fù) 鏈 DN A ， 再 以 負(fù) 鏈 DN A 為 模 板 合 當(dāng) 病毒 DN A 鏈合 成時 ， 核心 顆 粒 進(jìn) 入內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng)中 的高 爾 基體 獲得 糖 蛋白 包膜 放 （見 圖 1- 2 ） [ 1] 。

汕頭 大 學(xué)醫(yī) 學(xué) 院碩 士 學(xué) 位 染 的 早 期 階 段 ， 天 然 免 疫 反 應(yīng) 主 要 是 促 進(jìn) To l l 樣 受 體 （T o l l -l i ke re c e pt o r ， TL R ) 的 識對 病 毒入 侵 ，激 活 自 然殺 傷 細(xì)胞 （ na t ur a l ki l le r ce l l s ，N K ）或 NK T 細(xì)胞 和表 達(dá) 產(chǎn) 生許 病 毒 細(xì)胞 因 子， 其 中包 括 能抑 制 病毒 復(fù) 制的 Ⅰ 型干 擾 素（ i nt er f e r on s ，I F N ）。另 外 ，這 胞 因子 可 能激 活 附 近 的免 疫 細(xì) 胞 ，還 有 募 集免 疫 細(xì)胞 進(jìn)入 受 感染 組織 并 激活 這些 細(xì) 胞 免 疫 效應(yīng) 功 能 的能 力 。 中性 粒 細(xì)胞 （ n eu t ro p hi l s ）、樹 突狀 細(xì) 胞 （ de n dr i t i c ce l l s ，D C )細(xì) 胞 （ m ac r o ph ag e s ）、N K 細(xì) 胞和 NK T 細(xì) 胞等 受 活化 和 吸引 的天 然 免疫 細(xì) 胞共 同 組成 免 疫 防御 體系 （ 見圖 1 -3 ） [ 1 4 -1 7 ] 。迄 今 為 止， 干 擾素 和 核苷 酸類 似 物（ 如 ：拉 米 夫 替 卡 韋 ） 是 被 認(rèn) 為 治 療 慢 性 乙 肝 病 毒 感 染 的 主 要 方 法 ， 這 些 藥 物 抑 制 HB V 的 復(fù) 制 和地 減緩 肝 損傷 。 但 藥 物副 作 用 和 耐藥 性 嚴(yán) 重地 限 制這 些藥 物 的使 用， 因 此 ， 進(jìn) 一 步研

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 Courtney PROCHNOW;Ronda BRANSTEITTER;;APOBEC deaminases-mutases with defensive roles for immunity[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2009年10期

2 ;Development of Novel Therapeutics for Chronic Hepatitis B[J];Virologica Sinica;2010年04期

3 ;Inhibition of hepatitis B virus replication by APOBEC3G in vitro and in vivo[J];World Journal of Gastroenterology;2006年28期

4 Mihaela Petrova;Victor Kamburov;;Breastfeeding and chronic HBV infection: Clinical and social implications[J];World Journal of Gastroenterology;2010年40期

本文編號：2805194