【摘要】：背景:原發(fā)性膽汁性膽管炎(primarybiliarycholangitis,PBC)是以漸進性膽汁淤積,肝內(nèi)中、小膽管非化膿性破壞性炎癥為主要病理表現(xiàn)的自身免疫性肝病�！吧嫌巍碑惓Ｃ庖叻磻�(yīng)和“下游”纖維化損傷是PBC病情進展的兩大核心環(huán)節(jié)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有低免疫原性及獨特的免疫調(diào)節(jié)作用,有研究顯示MSCs移植可以緩解難治性PBC患者病情,但具體機制尚未完全闡明。半乳糖凝集素-9(galectin-9,Gal-9)屬于半乳糖凝集素家族(galectin,Gal),可有效調(diào)控免疫應(yīng)答,而Gal-9與PBC疾病活動度以及與MSCs具有怎樣的關(guān)聯(lián)性?仍有待進一步探討。膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cells,BECs)是PBC發(fā)病主要攻擊的靶細(xì)胞,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是介導(dǎo)PBC病程后期纖維化發(fā)展的重要“橋梁”,姜黃素則具有良好的抗纖維化作用。那么,姜黃素是否可以有效抑制PBC中BECs發(fā)生的EMT過程,目前尚不明確。目的:探討PBC患者體內(nèi)免疫失調(diào)與調(diào)控性分子Gal-9的相關(guān)性,以及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells,UC-MSCs)移植后的短期免疫調(diào)節(jié)效應(yīng);進一步通過UC-MSCs移植治療PBC模型鼠,探索UC-MSCs的療效及免疫調(diào)節(jié)機制;此外,本研究還初步探討了姜黃素對BECs被誘導(dǎo)發(fā)生EMT的效應(yīng)與作用機制。方法:1)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PBC患者外周血輔助性T細(xì)胞1(Thelp1,Thl),輔助性T細(xì)胞17(Thelp17,Th17)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcell,Treg)的變化。免疫組化法檢測干擾素-γ(interferon-γ,IFN-y),白細(xì)胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)及叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3(forkheadtranscriptionfactorp3,Foxp3)在PBC患者肝臟組織中的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測 PBC 患者血清中 Gal-9的表達(dá)水平,并與臨床生化指標(biāo)及免疫細(xì)胞亞群進行相關(guān)性分析。檢測PBC患者UC-MSCs移植24小時后Thl、Th17及Treg細(xì)胞亞群與血清中Gal-9的變化,并進行移植前后的比較分析。2)UC-MSCs輸注治療2-辛炔酸耦聯(lián)小牛血清蛋白(2-octynoicacidcoupled to bovine serum albumin,20A-BSA)誘導(dǎo)的PBC模型鼠,治療完成后統(tǒng)一處理。肝臟HE染色,并進行病理學(xué)評分。ELISA檢測丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(E2 components of the pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2)抗體和肝功能指標(biāo)。Luminex檢測血清中炎性因子的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測肝臟、脾臟及外周血中CD4+T細(xì)胞亞群變化。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)檢測肝臟組織中炎性因子的表達(dá)。體外利用RT-PCR、免疫印跡法(westernblot)及ELISA檢測IFN-y刺激UC-MSCs后Gal-9的表達(dá)水平及激活的信號通路蛋白。免疫磁珠分選法(magnetic activated cell sorting,MACS)分選C57BL/6鼠(B6鼠)脾臟CD4+T細(xì)胞,與UC-MSCs及Gal-9阻滯劑α-乳糖(α-lactose)共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞凋亡率和增殖率。MACS法分選B6鼠脾臟CD4+CD62L+(naive)初始T細(xì)胞,體外向Thl及Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并與UC-MSCs及α-lactose共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測Th1及Th17細(xì)胞百分率。將UC-MSCs與IFN-γ刺激后的BECs共培養(yǎng),并對Gal-9進行阻滯,RT-PCR檢測炎性趨化因子的變化。3)觀察姜黃素對TGF-β1誘導(dǎo)下BECs的形態(tài)學(xué)變化。免疫熒光法、western blot及RT-PCR檢測E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達(dá)。RT-PCR檢測EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail2、Twist1及ZEB1的表達(dá)。利用western blot進一步檢測Smad通路及Hedgehog通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1)與正常對照組相比,PBC患者外周血Th1細(xì)胞,Th17細(xì)胞百分率及絕對數(shù)顯著升高,而Treg細(xì)胞百分率及絕對數(shù)顯著降低。PBC患者肝臟組織中IFN-γ、IL-17A的表達(dá)顯著增多。PBC患者血清中Gal-9的表達(dá)水平顯著降低,且與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase,GGT)存在負(fù)相關(guān)性,與其外周血Th1、Th17細(xì)胞百分率呈負(fù)相關(guān)。UC-MSCs移植24小時后,PBC患者外周血Th1、Th17細(xì)胞百分率顯著下降,而Treg細(xì)胞百分率未見明顯變化。2)經(jīng)UC-MSCs移植治療后,PBC模型鼠肝臟損傷癥狀得到緩解,血清中PDC-E2抗體的表達(dá)水平顯著降低。UC-MSCs移植治療顯著下調(diào)PBC模型鼠體內(nèi)不同組織來源的Th1與Th17細(xì)胞數(shù)量,有效降低肝臟與血清中炎性因子的表達(dá)水平。UC-MSCs在IFN-y誘導(dǎo)下能夠分泌較高水平的Gal-9,并且UC-MSCs抑制CD4+T細(xì)胞增殖、阻礙naive T細(xì)胞向Th1、Th17細(xì)胞分化的作用與Gal-9密切相關(guān)。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信號通路與 c-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)信號通路參與調(diào)控UC-MSCs中Gal-9的產(chǎn)生。此外,UC-MSCs可以通過Gal-9降低IFN-γ刺激下BECs中促炎性趨化因子的表達(dá)。3)姜黃素干預(yù)48小時后即可改善BECs被誘導(dǎo)的EMT形態(tài)。免疫熒光法、western blot及RT-PCR檢測結(jié)果顯示,被誘導(dǎo)的BECs經(jīng)姜黃素處理后,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上升,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、α-SMA、N-cadherin表達(dá)下降,EMT的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子Snail2、Twist1、ZEB1的表達(dá)受到顯著抑制。姜黃素能夠通過上調(diào)負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白Smad7及SUFU的表達(dá)水平,下調(diào)激活蛋白的表達(dá)水平,抑制Smad及Hedgehog信號通路的活化。結(jié)論:PBC患者體內(nèi)存在局部與系統(tǒng)的免疫紊亂以及Gal-9表達(dá)異常;UC-MSCs通過分泌調(diào)控性分子Gal-9,從局部和系統(tǒng)兩方面進行免疫調(diào)節(jié),糾正PBC中的免疫失調(diào),從而控制住PBC發(fā)病“上游”的異常免疫反應(yīng);姜黃素則通過干擾BECs的EMT過程,有效抑制PBC發(fā)病“下游”的纖維化損傷。本研究同時提示針對PBC病情進展的不同階段,聯(lián)合多通路進行綜合治療,對于PBC患者大有裨益。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575
【圖文】：

２邋ＰＢＣ患者肝臟組織中ＩＦＮ－ｙ和ＩＬ－１７Ａ表達(dá)增多逡逑經(jīng)免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，相較于正常對照組，ＰＢＣ患者肝臟組織可見大量ＩＦＮ－Ｙ陽性逡逑細(xì)胞（圖２－２Ａ）；邋ＩＬ－１７Ａ主要表達(dá)于ＰＢＣ患者肝臟小膽管周圍，肝細(xì)胞胞漿及核內(nèi)均未見逡逑明顯浸潤，正常對照組肝臟中幾乎未見ＩＬ－１７Ａ陽表達(dá)（圖２－２Ｂ）；而Ｆｏｘｐ３主要表達(dá)于逡逑細(xì)胞核內(nèi)，與正常對照者相比，未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異（圖２－２Ｃ）。逡逑３０逡逑

１１（：組：１１＝５，＊＊＊：尸＜０．００１，＼２００）逡逑３邋ＰＢＣ患者血清中Ｃａ丨－９的表達(dá)水平顯著降低，且與肝臟損傷指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)逡逑利用ＥＬＩＳＡ檢測ＰＢＣ患者及正常對照組血清中Ｇａｌ－９的表達(dá)水平，如圖２－３Ａ所示，逡逑ＰＢＣ患者血清中的Ｇａｌ－９表達(dá)水平顯著低于正常對照組。此外，收集整理了這１５例ＰＢＣ逡逑患者的臨床生化檢測資料，進一步分析Ｇａｌ－９與肝功能損傷指標(biāo)之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示逡逑Ｇａｌ－９表達(dá)水平與血清中ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＧＧＴ的濃度均存在負(fù)相關(guān)忡（閣２－３Ｂ），但與逡逑血清中ＬＤＨ，邋ＣＨＥ的濃度來見明顯相關(guān)性（圖２－３Ｂ）。逡逑Ａ逡逑１５００］邐｜邐＊＊邐｜逡逑／＾Ｎ逡逑Ｉ邋１０００－邋ｒ＾－ｉ逡逑Ｏ）逡逑ｃｊ＞邐ｐ＾ＨＨｈ逡逑■逡逑Ｏ－ＬＪ邐．————逡逑ＨＣ邐ＰＢＣ逡逑３１逡逑

４邐ＰＢＣ患者血清Ｇａｌ－９表達(dá)水平與外周血Ｔｈｌ和Ｔｈｌ７細(xì)胞百分率存在負(fù)相關(guān)性逡逑將ＰＢＣ患者血清Ｇａｌ－９水平與其外周血Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ細(xì)胞百分率進行相關(guān)性分逡逑析，發(fā)現(xiàn)Ｇａｌ－９與Ｔｈｌ細(xì)胞百分率呈負(fù)相關(guān)（圖２－４Ａ），與Ｔｈｌ７細(xì)胞百分率存在負(fù)相關(guān)性逡逑（圖２－４Ｂ）；而與Ｔｒｅｇ細(xì)胞百分率無顯著相關(guān)性（圖２－４Ｃ）。逡逑ＡＢＣ逡逑ｒ＝－０．８５１邐ｒ＝－０．８７６邐々邐ｒ＝０．４Ｑ３逡逑”邐Ｐ＜邋０．００１邐３－ｉ邐Ｐ＜邋０．００１邐＋邋ｅ－，邐ｎｓ逡逑＃邋Ｖ邋？邐？邐＾邋１邐？？邋？逡逑：：Ｋ邋ｒ：邋＼邋．邋ｉ：逡逑0邐0邐入、，邐＋逡逑0－ｌ邐１邐１邐．邐１邐ｏ－ｌ邐，邐，邐，邐，邐Ｑ邋0－邐１邐．邐，邐

【參考文獻】

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本文編號：2804663