本文關(guān)鍵詞：mTORC1信號通路參與炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景與目的炎癥性腸病(IBD)是一種病變部位主要位于結(jié)腸及直腸的慢性腸道非特異性炎癥,具有慢性遷延、反復(fù)發(fā)作及難以治愈的特點(diǎn),主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD),臨床表現(xiàn)以腹痛、腹瀉、粘液膿血便和體重減輕為主。炎癥性腸病過去在西方國家發(fā)病率較高,近年來,隨著生活方式和飲食習(xí)慣的西化,我國發(fā)病率也呈逐年上升和年輕化趨勢。其與遺傳、環(huán)境、微生物和免疫等多個(gè)因素相關(guān),但確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明,腸道慢性炎癥是結(jié)直腸癌三大主要危險(xiǎn)因素之一,并與腸道炎癥病程、嚴(yán)重程度呈正相關(guān),病程超過30年的IBD患者,高達(dá)18%可發(fā)展為結(jié)直腸癌。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR (mammalian target of rapamycin)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其在體內(nèi)能形成兩種不同的復(fù)合物,分別是mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2)。mTORC1由mTOR、Raptor、mLST8和PRAS40組成,具有整合營養(yǎng)、生長因子、能量和應(yīng)激等一系列信號通路,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長、增殖和存活。在這些上游信號因子的作用下,mTORC1被兩種小的GTP酶所激活,分別是Rheb和Rags。結(jié)合上GTP的Rheb(此時(shí)該蛋白處于活化狀態(tài)),反過來被結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex 1/2, TSC1/2)所抑制。TSC1/2具有GTP酶活化蛋白(GAP)活性,能使Rheb上的GTP分解成為GDP,從而使Rheb失活。TSC1/2的缺失會導(dǎo)致組織細(xì)胞中mTORC1活性的持續(xù)激活,最終促進(jìn)炎癥和腫瘤的發(fā)生。雷帕霉素(Rapamycin)可特異性地抑制mTORCl信號。mTORC2包括mTOR、 mLST8、Rictor、PRR5和mSin1,有文獻(xiàn)表明在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞,mTORC2可調(diào)控肌動(dòng)蛋白聚合和細(xì)胞骨架重排。mTORC2可磷酸化AKT的疏水基序(HM)(Ser473位點(diǎn)),繼而使其成為具有完全活性的激酶,AKT是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的關(guān)鍵激酶之一,因而mTORC2可能在細(xì)胞存活、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)與運(yùn)動(dòng)中起調(diào)節(jié)作用,但其功能和活化機(jī)制目前尚不清楚。越來越多證據(jù)表明,mTOR信號通路在炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,是促炎關(guān)鍵因素。炎癥因子如TNF-α、VEGF、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-12p40及IFN-y等分泌均受mTOR信號調(diào)節(jié)。IL-6是一種重要的促炎因子,其作用主要通過可溶性IL-6受體、而非IL-6膜受體介導(dǎo),而mTOR活性增高可增加細(xì)胞內(nèi)可溶性IL-6受體表達(dá)。另外,在炎癥相關(guān)的胃癌小鼠(gp130)模型中,IL-6通過GP130/JAK通路激活STAT3的同時(shí),也激活PI3K/mTORCl,而mTORC1抑制劑RAD001可顯著抑制炎癥,從而抑制炎癥相關(guān)的胃癌發(fā)生。流行病學(xué)顯示,高脂飲食是炎癥性腸病發(fā)生的一個(gè)重要因素,而高脂飲食可使mTOR通路持續(xù)激活。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),高脂飲食大鼠肝細(xì)胞mTOR的磷酸化水平(p-mTOR)與IL-la、IL-6和TNF-a的表達(dá)水平均升高,且p-mTOR與TNF-a的表達(dá)水平呈正相關(guān)。在小鼠炎癥性腸病和結(jié)直腸癌的模型中,炎癥病灶與腫瘤病灶的mTOR-STAT活性均增強(qiáng),且炎癥病灶小腸上皮細(xì)胞的增殖依賴于mTORC1的活性。臨床數(shù)據(jù)資料顯示,約57%炎癥性腸病人標(biāo)本中觀察到mTORC1信號通路的活化。可見,mTOR信號通路與炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。然而,炎癥性腸病與mTORCl的相互關(guān)系尚未見報(bào)道。二、研究方法1、應(yīng)用Cre-loxp系統(tǒng),我們成功構(gòu)建了結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tsc1敲除小鼠。應(yīng)用PCR和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行小鼠基因型的鑒定,用western blot和免疫熒光確定Tscl敲除效果。2、通過對Tscl敲除小鼠發(fā)育觀察和結(jié)腸組織的分析,探索mTORC1過度激活對2月齡大的小鼠生長發(fā)育、結(jié)腸結(jié)構(gòu)與功能的影響。3、應(yīng)用葡聚糖硫酸鈉(DSS)模擬C57小鼠炎癥性腸病模型,通過大便性狀,大便隱血試驗(yàn),體重變化趨勢和結(jié)腸組織HE切片評估小鼠炎癥性腸病嚴(yán)重程度。4、通過給予C57腸炎小鼠mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素處理,探討雷帕霉素可否逆轉(zhuǎn)DSS造成的小鼠腸炎。5、通過結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tscl, Raptor敲除小鼠DSS誘導(dǎo)腸炎,探索mTORC1激活/抑制對小鼠炎癥性腸病的影響。6、通過對特異性Tscl敲除小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞mRNA芯片高通量篩查,初步探討mTORC1信號通路對IBD發(fā)生發(fā)展的影響。三、研究結(jié)果1、構(gòu)建結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tscl敲除小鼠,并證明其對2月齡大小鼠生長發(fā)育、結(jié)腸結(jié)構(gòu)與功能無明顯影響我們應(yīng)用Cre-loxp系統(tǒng)(Carl-cre, Tsc1loxp/loxp)實(shí)現(xiàn)了在結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性地Tsc1敲除,構(gòu)建了結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tscl敲除小鼠(Tsc1KO)。為了驗(yàn)證基因敲除效果,我們應(yīng)用PCR和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型的鑒定,并完整游離小鼠結(jié)腸全長,分離結(jié)腸上皮細(xì)胞,取結(jié)腸組織固定包埋,通過western blot檢測結(jié)腸上皮細(xì)胞Tsc1蛋白表達(dá)水平和免疫熒光檢測小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞mTORC1的下游靶蛋白S6的磷酸化水平。我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸上皮細(xì)胞Tscl特異性敲除小鼠Tscl蛋白表達(dá)水平下降而p-S6 (S235/S236)的水平顯著升高�？梢�,通過Cre-loxp系統(tǒng),我們成功實(shí)現(xiàn)了結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性敲除Tscl基因,并檢測到mTORC1活性的過度激活。接著我們對比了2月齡大結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tscl敲除小鼠的外形、毛色和體重,測量結(jié)腸全長長度,通過顯微鏡結(jié)合HE切片觀察小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu),以及通過PAS染色評估杯狀細(xì)胞分泌功能,均未見野生型小鼠和敲除小鼠有明顯差異�？梢�,小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tscl敲除,對2月齡大小鼠生長發(fā)育、結(jié)腸結(jié)構(gòu)與功能均無明顯影響。2、DSS誘導(dǎo)的C57小鼠炎癥性腸病模型可被mTORCl的特異性抑制劑——雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)我們運(yùn)用DSS構(gòu)建C57小鼠炎癥性腸病模型。通過對小鼠大便性狀,大便隱血試驗(yàn),體重變化趨勢和結(jié)腸組織HE切片評估小鼠炎癥性腸病嚴(yán)重程度。我們發(fā)現(xiàn),自由飲用DSS后,C57小鼠均出現(xiàn)不同程度的腹瀉,大便隱血或血便,體重逐步減輕。肉眼可見結(jié)腸充血、水腫、變短,HE切片光鏡下觀察可見結(jié)腸結(jié)構(gòu)明顯破壞,出現(xiàn)以結(jié)腸末端為主小潰瘍,黏膜及黏膜下層大量炎癥細(xì)胞浸潤。而同時(shí)給予雷帕霉素灌胃的小鼠,無論是大便性狀,大便隱血試驗(yàn),體重變化的臨床指標(biāo),或是HE切片病理評估,都得到不同程度的緩解。證明了mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素可部分逆轉(zhuǎn)DSS造成的C57小鼠炎癥性腸病。3、小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞mTORC1過度激活加劇了DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步探討了小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性敲除Tscl, Ratpor致mTORC1過度激活／抑制對DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病的影響。我們觀察可得,給予DSS自由飲用的結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tscl敲除小鼠,腹瀉、大便隱血或血便、體重減輕程度、小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)破壞均比野生型小鼠嚴(yán)重。接著,我們在Raptor敲除小鼠上重復(fù)了DSS模型,上述各項(xiàng)指標(biāo)均在Raptor敲除鼠中得到不同程度的改善。因此,我們認(rèn)為小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞mTORCl過度激活加劇了DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病。4、特異性Tscl敲除小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞mRNA芯片高通量篩查,探討mTORCl信號通路對IBD發(fā)生發(fā)展的影響。應(yīng)用mRNA芯片高通量篩查,我們發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性敲除Tscl基因,其炎癥、趨化相關(guān)的mRNA表達(dá)明顯高于野生型小鼠。篩查結(jié)果顯示：與目前IBD研究密切相關(guān)的IL-6、IL-17、IL-23、TNFa和COX的炎癥因子表達(dá),在Tscl敲除鼠中,均有3倍以上的增高。因而,我們推測：小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Tscl基因敲除,mTORC1信號通路過度激活,通過經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT3調(diào)控炎癥因子的表達(dá),在外源性刺激作用下,通過增加促炎因子的表達(dá),降低抗炎因子的表達(dá),促進(jìn)IBD的發(fā)生發(fā)展。四、結(jié)論1、結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tsc1敲除對2月齡大小鼠生長發(fā)育、結(jié)腸結(jié)構(gòu)與功能無明顯影響。2、mTORC1特異性抑制劑——雷帕霉素可部分逆轉(zhuǎn)C57小鼠DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病。3、小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞mTORC1過度激活加重了小鼠炎癥性腸病程度。4、特異性Tscl敲除小鼠結(jié)腸上皮mRNA芯片高通量篩查初步闡明了mTORC1信號通路參與IBD發(fā)生發(fā)展。5、mTORC1信號通路為IBD的發(fā)生發(fā)展提供新的解釋機(jī)制,mTORC1抑制劑可能為炎癥性腸病的治療提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白Tsc1 結(jié)腸上皮細(xì)胞 基因敲除DSS 炎癥性腸病
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R574
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-24
• 1.1 炎癥性腸病的研究現(xiàn)狀16-18
• 1.2 mTOR信號通路18-20
• 1.3 葡聚糖硫酸鈉(DSS)炎癥性腸病動(dòng)物疾病模型20-21
• 1.4 Cre-loxp系統(tǒng)與基因敲除21-24
• 材料與方法24-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24
• 2.2 試劑及耗材24
• 2.3 主要儀器24-25
• 2.4 方法25-43
• 結(jié)果43-58
• 3.1 構(gòu)建結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性Tsc1敲除小鼠,并證明其對2月齡大小鼠生長發(fā)育、結(jié)腸結(jié)構(gòu)與功能無明顯影響43-47
• 3.2 DSS誘導(dǎo)的C57小鼠炎癥性腸病模型可被mTORC1的特異性抑制劑——雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)47-50
• 3.3 小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞mTORC1過度激活加劇了DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病50-53
• 3.4 特異性Tsc1敲除小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞mRNA芯片高通量篩查,初步探討mTORC1信號通路對IBD發(fā)生發(fā)展的影響53-58
• 討論58-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 中英文縮略詞對照表68-71
• 碩士研究生期間發(fā)表論文情況71-72
• 致謝72-73

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：280416