【摘要】：背景 病毒性疾病是人類健康面臨的嚴(yán)重威脅。在許多老的病毒性疾病時(shí)有發(fā)病的同時(shí),新的病毒,特別是致死性強(qiáng)的新毒株不斷出現(xiàn),有的甚至?xí)纬杀┌l(fā)式流行。在新出現(xiàn)的病毒性傳染病面前,人群缺乏免疫力,而且短時(shí)間內(nèi)也找不到有效的預(yù)防、治療和控制辦法。臨床上使用的抗病毒治療藥物(干擾素)雖然療效明顯,但是存在一定的副作用�；蛑委煵呗栽隗w外具有明顯的抑制病毒復(fù)制作用,充分發(fā)揮基因治療的抗病毒優(yōu)勢(shì),建立一種能促使治療分子高效、靶向進(jìn)入病毒感染細(xì)胞的在體給藥方法具有十分重要的意義,但由于缺乏有效特異的輸送載體,基因治療抗病毒策略未得到深入研究。 細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)可以高效的跨過(guò)細(xì)胞膜并把所攜帶的生物活性分子運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)。HBV表面蛋白PreS2結(jié)構(gòu)域中包含一段具有CPP特性的轉(zhuǎn)位基序(translocation motif, TLM),位于41-52氨基酸(PreS2-TLM), PreS2-TLM可不依賴于受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白非能量依賴性地將與其融合表達(dá)的蛋白帶入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。單鏈抗體(single chain Fv, ScFv)分子量雖小,但是保留了與抗原結(jié)合的特異性,將治療分子與ScFv進(jìn)行偶聯(lián)或融合后可引導(dǎo)治療分子高濃度靶向聚集于抗原表達(dá)的細(xì)胞表面�；蛑委熤�,為了保證治療分子的靶向結(jié)合和高效性進(jìn)入靶細(xì)胞,可將CPP和特異性ScFv融合構(gòu)成可穿過(guò)細(xì)胞膜的抗體,即靶向穿膜體。在HBV感染的肝細(xì)胞表面表達(dá)有HBV表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg),針對(duì)HBsAg的抗體可高效特異地與其結(jié)合。 在現(xiàn)有的幾種HBV基因治療策略中,HBV核心蛋白顯性負(fù)性突變體體外抑制病毒復(fù)制的效率最高。所以,本研究以HBV為研究對(duì)象,探索一條靶向抑制HBV復(fù)制的新途徑,從而為已有的、及未來(lái)可能出現(xiàn)的難治性病毒性疾病探索一條新的治療思路。 方法 利用分子克隆與DNA重組技術(shù),構(gòu)建在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組質(zhì)粒pPreS2-TLM-ScFv-EGFP;以限制性內(nèi)切酶與DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒；以轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒抽提試劑盒對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行抽提與純化；用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell, CHO),以Zeocin篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；用熒光顯微鏡觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的表達(dá)；用流式細(xì)胞儀測(cè)定表達(dá)PreS2-TLM-ScFv-EGFP融合蛋白的細(xì)胞陽(yáng)性率；以Western blot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP;以含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的上清分別孵育HepG2.2.15、HepG2與HeLa細(xì)胞,以Texas標(biāo)記的抗GFP單克隆抗體通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)的定位；以激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光的染色結(jié)果；利用PCR與DNA重組技術(shù)構(gòu)建HBc顯性負(fù)性突變體HBcDN和重組質(zhì)粒pPreS2-TLM-ScFv-HBcDN;以限制性內(nèi)切酶與DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒；用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pPreS2-TLM-ScFv-HBcDN入CHO細(xì)胞,以Zeocin和有限稀釋法篩選表達(dá)融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的穩(wěn)定細(xì)胞株；以DNA與RNA抽提試劑盒提取并純化穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)的總DNA與總RNA,分別作為PCR與RT-PCR的模板,以插入片段的特異性引物分別擴(kuò)增HBcDN, PreS2-TLM-ScFv與PreS2-TLM-ScFv-HBcDN,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；用Western blot檢測(cè)融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的表達(dá)；收集含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的細(xì)胞上清孵育HepG2.2.15細(xì)胞；參考文獻(xiàn)報(bào)道方法提取HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)病毒的核心顆粒,以RNA抽提試劑盒純化核心顆粒內(nèi)包裝的HBV前體RNA,以相對(duì)定量RT-PCR的方法分析核心顆粒內(nèi)包裝的HBV前體RNA水平。 結(jié)果 用DNA序列比對(duì)軟件EditSeq將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與已知的序列進(jìn)行比對(duì)分析顯示編碼融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的序列完全正確。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP主要分布在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的細(xì)胞陽(yáng)性率為83.47±6.05%。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP。激光共聚焦顯微鏡顯示的免疫熒光結(jié)果表明Texas標(biāo)記的抗GFP單克隆抗體在融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP孵育過(guò)的HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)有明顯的染色且HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)的總熒光強(qiáng)度明顯高于HepG2、HeLa細(xì)胞內(nèi)的總熒光強(qiáng)度。 用DNA序列比對(duì)軟件EditSeq將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與已知的序列進(jìn)行比對(duì)分析顯示融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的編碼序列完全正確。穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的細(xì)胞命名為CHO-HBcDN,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示分別以CHO-HBcDN細(xì)胞的總DNA與總RNA為模板的PCR與RT-PCR均獲得了與插入片段大小對(duì)應(yīng)的條帶。Western blot結(jié)果表明在CHO-HBcDN細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN。定量RT-PCR結(jié)果的比較分析表明當(dāng)HepG2.2.15細(xì)胞暴露于上清24、48與72h時(shí),體積占培養(yǎng)基總體積25%的CHO-HBcDN上清,能夠顯著抑制HBV前體RNA的包裝；當(dāng)HepG2.2.15細(xì)胞暴露于上清72h時(shí),12.5%的CHO-HBcDN上清也能夠顯著抑制HBV前體RNA的包裝。 結(jié)論 本研究中,PreS2-TLM-ScFv-EGFP融合蛋白在CHO細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)后分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清；上清中的PreS2-TLM-ScFv-EGFP能夠特異性地穿透至HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白在CHO細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)并分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清；上清中的PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白能夠抑制HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒前體RNA在核心顆粒內(nèi)的包裝；細(xì)胞上清中含有的PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的抑制作用與HepG2.2.15細(xì)胞暴露于上清的濃度和時(shí)間有關(guān)。25%的上清是抑制病毒復(fù)制的最佳濃度。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王憲鋒,劉忠湘,李淑梅,繆軍,李s

本文編號(hào)：2801084