【摘要】：目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)為長期大量酒精攝入或短期過量飲酒所致的肝臟疾病,其初期通常表現(xiàn)為脂肪肝,嚴重者可進展至脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝硬化。酒精引起肝功能損傷的具體機制尚不十分明確,目前有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺(ceramide)參與到其發(fā)病過程中。神經(jīng)酰胺屬于鞘磷脂類,參與構成生物膜,并為鞘磷脂信號途徑中重要的第二信使,能夠激活多種蛋白激酶和蛋白磷酸酶如蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A),調節(jié)凋亡、增殖等信號過程。乙醇激活酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)后,使神經(jīng)酰胺生成增多,通過蛋白磷酸酶2A影響腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK),使活化的AMPK去磷酸化失活,進而影響到下游一系列脂代謝調節(jié)基因,導致肝細胞內脂肪堆積。本研究采用酒精灌胃方式建立大鼠ALD模型,通過分子生物學方法探討神經(jīng)酰胺、酸性鞘磷脂酶及蛋白磷酸酶2A在酒精性肝病發(fā)病機制中的作用。方法:選擇健康雄性Wistar大鼠50只,體重180-220g,經(jīng)過正常喂養(yǎng)l周之后,隨機分配10只作為正常對照組,其余大鼠作為模型組每日灌入酒精,并分別在第4周、8周、12周和16周末處死模型組大鼠10只、9只、8只和8只。取出大鼠肝臟后,用4%中性甲醛溶液固定一部分肝組織,經(jīng)石蠟包埋后切片,行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色以觀察其病理改變,其余組織-80℃保存待用。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)法檢測ASMase、PP2A的mRNA表達水平,免疫組化技術、Western-blot檢測ASMase、PP2A的蛋白表達水平。高效液相色譜-質譜聯(lián)用法(HPLC-MS)檢測肝組織神經(jīng)酰胺含量。結果:1肝臟組織病理學改變:4周大鼠肝細胞可見脂肪變性,至8周、12周,脂肪變加重,炎癥增多并伴隨纖維組織增生,至16周,肝細胞呈彌漫小泡性脂變,可見肝竇周圍纖維化、匯管區(qū)的纖維組織增生,并觀察到已形成的纖維間隔。2免疫組化技術檢測各指標蛋白表達水平:正常組大鼠肝組織中ASMase、PP2A陽性表達較少,酒精模型組陽性表達量呈增加趨勢。3 RT-qPCR法檢測各指標mRNA表達的變化:正常組大鼠肝組織中ASMase、PP2A mRNA表達量較少,酒精模型組mRNA表達量逐漸增加,與正常對照組相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。4 Western-blot檢測各指標蛋白表達水平的變化:正常組大鼠肝組織中ASMase、PP2A蛋白表達量較少,酒精模型組表達量呈增加趨勢,與正常對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.01)。5高效液相色譜-質譜聯(lián)用法檢測肝組織中神經(jīng)酰胺的含量:酒精模型組大鼠肝內神經(jīng)酰胺含量逐漸增加,與正常對照組相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。結論:1應用酒精喂養(yǎng)制備的大鼠酒精性肝病模型,其肝臟脂肪變性、炎癥程度及纖維化改變可以基本反映酒精性肝病的病理學改變,應用此動物模型研究酒精性肝病的發(fā)病機制具有一定科學性。2應用不同實驗方法檢測神經(jīng)酰胺、酸性鞘磷脂酶及蛋白磷酸酶2A的表達水平,結果均隨脂變程度的加重而逐漸升高,提示這三者及其之間的相關性可能參與到酒精性肝病的發(fā)病機制中。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575

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本文編號：2797713