【摘要】：慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,宿主免疫調(diào)節(jié)紊亂是導(dǎo)致不能有效清除病毒、病情遷延不愈的重要原因。許多研究表明Th1、Th2細(xì)胞亞群的比例失衡、功能失調(diào)是導(dǎo)致慢性乙型肝炎發(fā)病的重要因素。 Th17細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群,以產(chǎn)生白介素17(IL-17)為特征。Th17細(xì)胞的分化需要IL-6存在條件下轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)的活化。維甲酸相關(guān)孤核受體γt(RORγt)作為維甲酸相關(guān)孤核受體亞家族的成員之一,屬于類固醇受體超家族。大量研究表明RORγt和RORα是調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化的重要因子,尤其RORγt發(fā)揮主要作用。 大量證據(jù)表明Th17細(xì)胞亞群比例增加在慢性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用,調(diào)節(jié)慢性乙型肝炎患者中Th17細(xì)胞的異常可能成為慢性乙型肝炎治療的新策略。但是,對(duì)于RORγt和RORα在慢性乙型肝炎的發(fā)病中如何發(fā)揮作用尚很少有研究。 目的 本研究的目的是通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎患者外周血RORγt和RORα基因表達(dá),Th17細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子的檢測(cè),進(jìn)一步探討RORγt和RORα在慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用及評(píng)價(jià)它們的臨床相關(guān)性。 方法 應(yīng)用三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照外周血中Th17細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)]RORγt和RORα在慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照血清中IL-6,TGF-β,IL-17,IL-23和IFN-γ的表達(dá)水平。 結(jié)果 1、慢性乙型肝炎患者Th17細(xì)胞亞群的比例(1.77±0.52%)較正常對(duì)照組(0.33±0.15%)顯著升高(P0.05)。 2、慢性乙型肝炎患者外周血RORα的mRNA水平(6.442×10-2±3.17×10-2)明顯高于正常對(duì)照組(1.666×10-3±8.77×104,P0.05),慢性乙型肝炎患者外周血RORyt的mRNA水平(1.217×10-3±0.787x10-3)明顯高于正常對(duì)照組(3.207×10-4±1.38×10-4,P0.05)。 3、慢性乙型肝炎患者血清IL-6水平(13.36±3.79pg/ml)較正常對(duì)照組明顯升高(3.43±0.55pg/ml,P0.01)；血清TGF-(3水平(35.22±2.4ng/ml)較正常對(duì)照組明顯升高(18.28±1.8ng/ml,P0.01);慢性乙型肝炎患者血清IFN-y水平(10.17±3.38pg/ml)較正常對(duì)照組明顯降低(17.14±2.28pg/ml,P0.05);慢性乙型肝炎患者血清IL-17和IL-23水平(65.38±11.65pg/ml,51.10±6.69pg/ml)較正常對(duì)照組(61.07±8.84pg/ml,45.87±4.47pg/ml)無(wú)明顯差異(P≥0.05)。 4、在慢性乙型肝炎患者中,RORγt.IL-6、IL-23與Th17細(xì)胞亞群比例存在明顯的正相關(guān)性(r=0.563,P=0.01；r=0.403,P=0.027；r=0.447,P=0.013),但RORα、 TGF-β、IFN-γ與Th17細(xì)胞亞群比例無(wú)相關(guān)性。 5、慢性乙型肝炎患者外周血中Th17細(xì)胞亞群比例與ALT呈明顯正相關(guān)(r=0.587,P=0.005),RORγt與ALT呈明顯正相關(guān)(r=0.384,P=0.036),但RORα與ALT無(wú)相關(guān)性(r=0.064,P=0.738)；RORγt、RORα和Thl7細(xì)胞亞群比例與外周血HBV-DNA均無(wú)相關(guān)性(r=0.031,P=0.871；r=0.315,P=0.090；r=0.222,P=0.239)。 結(jié)論 我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明,在慢性乙型肝炎發(fā)生和發(fā)展中,Th17細(xì)胞亞群比例增加具有重要的作用；研究首次表明,作為Th17細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子,RORγt在慢性乙型肝炎的發(fā)病中可能具有重要作用。 HBV感染可引起人類急慢性肝炎,與肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),其中每年約有1%的乙型肝炎患者發(fā)展為重型肝炎。重型肝炎可分為急性重型肝炎(acute severe type hepatitis、亞急性重型肝炎(subacute severe type hepatitis, SSH)、慢性重型肝炎(chronic severe type hepatitis,CSH)。其中慢性重型肝炎又可分為慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)和慢性肝衰竭(chronic liver failure,CLF)。慢加急性肝衰竭是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝臟功能失代償。 在我國(guó),慢性乙型病毒性肝炎是引起慢加急性肝衰竭的主要病因,由慢性乙型病毒性肝炎所致的慢加急性肝衰竭又稱為慢加急性重型乙型病毒性肝炎(ACHBLF)。ACHBLF進(jìn)展迅速,病情兇險(xiǎn),臨床上缺乏特異、有效的治療手段,絕大部分患者預(yù)后較差。ACHBLF的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。 在我們的第一部分實(shí)驗(yàn)中,我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在慢性乙型肝炎異常免疫反應(yīng)中,Th17細(xì)胞亞群比例增加具有重要的作用；研究首次表明,作為Th17細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子,RORγt在慢性乙型肝炎的發(fā)病中可能具有重要作用。 目的 本研究的目的是通過(guò)對(duì)慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者外周血RORγt和RORα基因表達(dá),Th17細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子的檢測(cè),進(jìn)一步探討RORγt和RORβ在慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法 應(yīng)用三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者和正常對(duì)照外周血中Th17細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)RORγt和RORα在慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者和正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者和正常對(duì)照血清中IL-6,TGF-β,IL-17,IL-23和IFN-γ的表達(dá)水平。 結(jié)果 1、慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者外周血Th17細(xì)胞亞群比例(3.87±0.97%)明顯高于慢性乙型肝炎患者(1.77±0.52%,P0.01)和正常對(duì)照組(0.33±0.15%,P0.01)。 2、慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者外周血RORα的mRNA水平(2.38×10-1±1.04×10-1)明顯高于慢性乙型肝炎患者(6.442×10-2±3.17×10-2,P0.05)和正常對(duì)照組(1.666×10-3±8.77×104,P0.05),慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者外周血RORγt的mRNA水平(2.904×10-2±1.01×10-2)明顯高于慢性乙型肝炎患者(1.217×10-3±0.787×10-3,P0.05)和正常對(duì)照組(3.207×10-4±1.38×10-4,P0.01)。 3、慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者血清IL-6水平(44.56+16.55pg/ml)較慢性乙型肝炎患者(13.36±3.79pg/ml)和正常對(duì)照組明顯升高(3.43±0.55pg/ml,P0.01)；血清TGF-β水平(55.78±1.6ng/ml)較慢性乙型肝炎患者(35.22±2.4ng/ml,P0.05)和正常對(duì)照組明顯升高(18.28±1.8ng/ml,P0.01);血清IFN-γ水平(13.61±5.6pg/ml)較慢性乙型肝炎患者(10.17±3.38pg/ml)明顯升高(P0.05),但較正常對(duì)照組明顯降低(17.14±2.28pg/ml,P0.05);血清IL-17和IL-23水平(77.24±9.69pg/ml,55.96±25.45pg/ml)較慢性乙型肝炎患者(65.38±11.65pg/ml,51.10±6.69pg/ml)和正常對(duì)照組(61.07±8.84pg/ml,45.87±4.47pg/ml)無(wú)明顯差異(P≥0.05)。 4、在慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者中,RORγt、IL-6、IL-23與Th17細(xì)胞亞群比例存在明顯的正相關(guān)性(r=0.321,P=0.044；r=0.360,P=0.027；r=0.383,P=0.015),但RORα、TGF-β、IFN-γ與Th17細(xì)胞亞群比例無(wú)相關(guān)性。 5、慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者RORγt與PTA, TBIL和MELD存在明顯的正相關(guān)性(r=-0.393,P=0.012；r=0.391,P=0.013；r=0.359,P=0.023)；但是RORγt-與ALT和HBV-DNA無(wú)相關(guān)性(r=-0.122,P=0.458；r=-0.303,P=0.057)。RORα與上述各指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性。 6、根據(jù)患者的結(jié)局,將慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者分為生存組和死亡組,發(fā)現(xiàn)死亡組患者RORγt和RORα水平(4.48×10-2±1.3×10-2,4.78×10-1±9.19×10-2)高于生存組(3.34×10-2±1.5×10-,23.55×10-1±7.65×10-2),但無(wú)明顯差異(P0.05)。同樣,外周血Thl7細(xì)胞亞群比例在死亡組(3.97±2.21%)高于生存組(2.25±±0.78%),但無(wú)明顯差異(P0.05)。RORγt、RORα水平和外周血Th17細(xì)胞亞群比例在HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者中無(wú)明顯差異(P0.05)。 結(jié)論 我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明,在慢加急性重型乙型病毒性肝炎的異常免疫反應(yīng)中,Th17細(xì)胞在發(fā)病中具有重要的作用；研究首次表明,RORγt和RORα在慢加急性重型乙型病毒性肝炎的發(fā)病過(guò)程中可能具有重要作用,RORγt-與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān),可能作為判斷慢加急性重型乙型病毒性肝炎疾病預(yù)后情況的因子之一。 原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一。原發(fā)性肝癌約90%以上為肝細(xì)胞肝癌,5%左右為膽管細(xì)胞肝癌,兩者混合的肝癌罕見。本病病因和發(fā)病機(jī)制尚未確定,我國(guó)肝癌患者中約90%有乙型肝炎病毒(HBV)感染背景。原發(fā)性肝癌死亡率高,我國(guó)每年死于肝癌的人數(shù)超過(guò)11萬(wàn),在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌、食道癌而居第三位。 肝癌患者體內(nèi)細(xì)胞免疫功能受損,抗腫瘤能力下降,可能是肝癌患者抗腫瘤免疫應(yīng)答缺陷的機(jī)制之一。近年來(lái),Th17在腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究受到越來(lái)越多人的重視。有研究認(rèn)為Th17促進(jìn)腫瘤發(fā)展,也有研究認(rèn)為Thl7可以清除腫瘤細(xì)胞。多項(xiàng)研究提供的證據(jù)表明RORs在癌癥中的作用,RORs表達(dá)或活性的改變可能會(huì)導(dǎo)致Th17細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子的變化,從而正向或負(fù)向地影響癌癥的發(fā)展。 在我們的前兩部分實(shí)驗(yàn)中,我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在慢性乙型肝炎、ACHBLF的異常免疫反應(yīng)中,Th17細(xì)胞亞群比例增加具有重要的作用；研究首次表明,作為Th17細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子,RORγt在慢性乙型肝炎的疾病進(jìn)展過(guò)程中可能具有重要作用。本研究有助于我們揭示Th17和RORγt在肝癌中所起到的作用以及與疾病進(jìn)展的關(guān)系,從而為臨床治療提供理論依據(jù)和新的途徑。 目的 本研究的目的是通過(guò)對(duì)原發(fā)性肝癌患者外周血RORγt和RORa基因表達(dá),Th17細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子的檢測(cè),進(jìn)一步探討RORyt和RORa在原發(fā)性肝癌患者發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法 應(yīng)用三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者和正常對(duì)照外周血中Th17細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)RORγt和RORa在原發(fā)性肝癌患者和正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者和正常對(duì)照血清中IL-6,TGF-β,IL-17,IL-23和IFN-γ的表達(dá)水平。 結(jié)果 1、原發(fā)性肝癌患者外周血Thl7細(xì)胞亞群比例(3.58±1.07%)明顯高于慢性乙型肝炎患者(1.77±0.52%,P0.05)和正常對(duì)照組(0.33±0.15%,P0.01)。 2、原發(fā)性肝癌患者外周血RORβ的mRNA水平(9.96×10-2±3.74x10-2)明顯高于慢性乙型肝炎患者(6.442×10-2±3.17×10-2,P0.05)和正常對(duì)照組(1.666×10-3±8.77×104,P0.05),原發(fā)性肝癌患者外周血RORγt的mRNA水平(1.32×10-2±2.08x10-3)明顯高于慢性乙型肝炎患者(1.217×10-3±0.787×10-3,P0.05)和正常對(duì)照組(3.207×104±1.38×10-4,P0.01)。 3、原發(fā)性肝癌患者血清IL-6水平(34.86±3.02pg/ml)較慢性乙型肝炎患者(13.36±3.79pg/ml)和正常對(duì)照組明顯升高(3.43±0.55pg/ml, P0.01);血清TGF-β水平(44.95±11.16ng/ml)較慢性乙型肝炎患者(35.22±2.4ng/ml,P0.05)和正常對(duì)照組明顯升高(18.28±1.8ng/ml,P0.01);原發(fā)性肝癌患者血清IFN-γ水平(12.8±3.49pg/ml)較慢性乙型肝炎患者(10.17±3.38pg/ml)明顯升高(P0.05),但較正常對(duì)照組明顯降低(17.14±2.28pg/ml,P0.05);原發(fā)性肝癌患者血清IL-17和IL-23水平(71.24±6.43pg/ml,56.38±6.49pg/ml)較慢性乙型肝炎患者(65.38±11.65pg/ml,51.10±6.69pg/ml)和正常對(duì)照組(61.07±8.84pg/ml,45.87±4.47pg/ml)無(wú)明顯差異(P≥0.05)。 4、在原發(fā)性肝癌患者中,RORγt、IL-6與Th17細(xì)胞亞群比例存在明顯的正相關(guān)性(r=0.396,P=0.049；r=0.402,P=0.047),RORα、TGF-β、IL-23、IFN-γ與Th17細(xì)胞亞群比例無(wú)相關(guān)性(r=0.126,P=0.548；r=0.143,P=0.496；r=0.247,P=0.234；r=0.310,P=0.132)。 5、按照TNM分期標(biāo)準(zhǔn),將原發(fā)性肝癌患者分為Ⅰ期5例,Ⅱ期6例,Ⅲ期12例,Ⅳ期7例,結(jié)果顯示RORγt和RORα水平隨著疾病的進(jìn)展逐漸上升,但無(wú)明顯差異(P0.05),分別為Ⅰ期(7.75×10-3±0.94×10-3,7.60×10-2±2.0×10-2),Ⅱ期(1.28×10-2±0.50×10-2,8.43×10-2±3.78×10-2),Ⅲ期(1.47×10-2±0.75×10-2,1.02×10-1±5.95×10-2),Ⅳ期(1.86×10-2±0.83×10-2,1.28×10-1±8.06×10-2)。外周血Th17細(xì)胞亞群比例同樣隨著疾病的進(jìn)展逐漸上升,分別為Ⅰ期(3.28±0.36%),Ⅱ期(4.00±1.51%),Ⅲ期(4.14±0.77%),Ⅳ期(4.35±1.37%),無(wú)明顯差異(P0.05)。根據(jù)患者的病情,將原發(fā)性肝癌患者分為肝功能代償組和肝功能失代償組,發(fā)現(xiàn)失代償組患者RORγt和RORa水平(1.48×10-2±0.66×10-2,1.11×10-1±6.19×10-2)高于代償組(1.38×10-2±0.6×10-2,8×10-2±3.16×10-2,),但無(wú)明顯差異(P0.05)。外周血Th17細(xì)胞亞群比例在失代償組(4.58±1.21%)高于代償組(3.48±0.59%),有明顯差異(P0.05)。RORγt、RORa水平在HBeAg陽(yáng)性的HCC患者分別為(1.46×10-2±0.46×10-2,1.04×10-1±6.08×10-2),與HBeAg陰性患者相比(1.17×10-2±0.66×10-2,9.50×10-2±5.58×10-2),無(wú)明顯差異(P0.05)。外周血Th17細(xì)胞亞群比例在HBeAg陽(yáng)性患者(4.06±1.01%)和HBeAg陰性患者(3.91±1.16%)無(wú)明顯差異(P0.05)。 結(jié)論 我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明,在原發(fā)性肝癌患者的異常免疫反應(yīng)中,Th17細(xì)胞在發(fā)病中具有重要的作用；研究首次表明,RORγt和RORa在原發(fā)性肝癌的發(fā)病過(guò)程中可能具有重要作用,與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān),可能作為判斷疾病預(yù)后情況的指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.62;R735.7

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本文編號(hào)：2797615