【摘要】：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(crohn's disease, CD),其病因與發(fā)病機制尚未完全明確。臨床流行病學(xué)資料證實兒童炎癥性腸病的發(fā)病率呈增高趨勢。據(jù)報道,兒童克羅恩病的發(fā)病率約為0.2-8.5/10萬,兒童潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率約為0.5-4.3/10萬。兒童期罹患炎癥性腸病可導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩和青春期的延遲,再加上長期的慢性腹痛、腹瀉,嚴重影響患兒的心理和社會功能,研究資料顯示IBD患兒健康相關(guān)生活質(zhì)量顯著低于正常兒童。與成人不同的是,兒童生活環(huán)境中的干擾因素相對較少(比如吸煙、避孕藥的使用),基因和腸道菌群在兒童炎癥性腸病發(fā)病機制中可能起著更為重要的作用,因此兒童IBD患者更適合于炎癥性腸病發(fā)病機制的研究。 炎癥性腸病,尤其是克羅恩病,被認為是宿主免疫功能紊亂和腸道菌群共同作用的結(jié)果。單層的腸上皮細胞構(gòu)成了機體防御腸腔病原微生物的第一道屏障。正常情況下,腸上皮細胞對腸道共生菌是耐受的,而對腸道共生菌免疫耐受的異常激活可能參與了炎癥性腸病的發(fā)病。鋅指蛋白A20(zinc finger proteinA20,A20)是1990年在研究臍靜脈內(nèi)皮細胞腫瘤壞死因子早期應(yīng)答基因時發(fā)現(xiàn)的,后來研究表明A20在多種細胞中均有表達,且多種刺激因素均可誘導(dǎo)A20表達水平的升高。另外,研究表明A20為核因子κB (nuclear factorκB, NF-κB)信號通路中關(guān)鍵的負性調(diào)控因子,在調(diào)控機體免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用。 NF-κB信號通路過度激活在炎癥性腸病發(fā)病機制中起核心作用。NF-κB是一種分布和作用均十分廣泛的真核細胞轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)控機體感染、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用。一系列自身免疫病的發(fā)生與NF-κB信號通路的異�；罨嘘P(guān),因此正常情況下NF-κB信號通路的活化受到嚴密的調(diào)控。鋅指蛋白A20對腫瘤壞死因子受體、Toll樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚域、T細胞或B細胞受體介導(dǎo)的NF-κB信號通路的活化均起著負性調(diào)控作用。另外,基因敲除實驗表明A20基因是機體抵抗炎癥反應(yīng)不可缺少的重要功能基因。A20基因缺陷的小鼠死于多臟器嚴重炎癥反應(yīng)。特異性敲除腸上皮細胞中A20基因的小鼠對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型易感性增加,且癥狀更為嚴重,撤去DSS后結(jié)腸炎癥狀不能恢復(fù)。另外,在英國進行的一項全基因組學(xué)關(guān)聯(lián)分析表明A20基因為克羅恩病的易感基因之一。但目前有關(guān)鋅指蛋白A20在炎癥性腸病發(fā)病機制中的作用尚無研究。本研究的目的旨在初步探索鋅指蛋白A20在炎癥性腸病發(fā)病機制中的作用。 第一部分鋅指蛋白A20在炎癥性腸病患兒腸粘膜中的表達及意義 [目的]探討炎癥性腸病患兒腸道炎癥反應(yīng)與鋅指蛋白A20表達水平之間的關(guān)系。 [方法]收集2008至2010年就診于我院并行腸鏡檢查的患兒腸道黏膜標本共57份。將標本分為正常對照組(n=16)、IBD緩解期組(n=12)、IBD活動期組(n=13)和非IBD腸炎組(n=16)。內(nèi)鏡下取各組患兒末端回腸黏膜標本,采用熒光定量PCR和免疫組化法檢測A20、NF-κB、IL-6.IL-8的表達水平。 [結(jié)果](1)NF-κB、A20在正常對照組腸黏膜中僅微量表達,IBD活動期組和非IBD腸炎組NF-κB、A20表達水平明顯高于正常對照組(P均0.01)；(2)IBD緩解期組較正常對照組NF-κB[(9.35±4.84)%vs(0.57±0.44)%,P0.01]、IL-6(P0.05)、IL-8(P0.05)表達水平高,而A20在mRNA水平(P0.05)和蛋白水平[(0.36±0.18)%vs(0.874±0.29)%,P0.01]上表達均偏低；(3)與非IBD腸炎組相比,IBD活動期組NF-κB[(24.17±11.27)%vs(55.29±21.84)%,P0.01、IL-6(P0.05)、IL-8(P0.01)表達水平明顯升高,而A20在mRNA(P0.05)和蛋白水平[(29.23±11.70)%vs(16.81±5.90)%,P0.01]上表達均較低；(4)IBD緩解期組與非IBD腸炎組相比,IL-6、IL-8表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05),而A20在mRNA水平(P0.01)和蛋白水平[(29.23±11.70)%vs(0.47±0.25)%,P0.01]上表達均較低。 [結(jié)論]IBD患兒存在腸道炎癥反應(yīng)過度而A20表達水平上調(diào)不足的現(xiàn)象；A20表達水平的異�？赡軈⑴c了IBD的發(fā)生和發(fā)展。 第二部分鋅指蛋白A20在調(diào)控腸上皮細胞炎癥反應(yīng)中的作用 [目的]探索鋅指蛋白A20在調(diào)控腸上皮細胞炎癥反應(yīng)中的作用。 [方法]構(gòu)建A20重組慢病毒載體,采用基因感染的方法分別沉默和過表達HT-29細胞中的A20基因；根據(jù)干預(yù)方式的不同,將細胞株分為三組,即HT-29細胞組,A20基因過表達組,A20基因沉默組。采用免疫熒光和western-blot的方法研究在腸上皮細胞遭受LPS刺激后增加和降低A20表達對NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響,其次采用ELISA的方法檢測增加和降低A20表達對NF-κB信號通路下游促炎細胞因子TNF-a、IL-1β表達水平的影響。 [結(jié)果](1)當腸上皮細胞遭受LPS刺激后,A20表達水平上調(diào),且隨著LPS刺激量的增加,A20表達水平有增高的趨勢；(2)A20基因沉默組細胞在遭受LPS刺激30分鐘后,進入核內(nèi)的NF-κB的量較HT-29細胞組和A20基因過表達組明顯增多(P0.05)；A20基因過表達組在遭受LPS刺激后進入核內(nèi)的NF-κB的量較HT-29細胞組明顯減少(P0.05)；(3)隨著LPS刺激時間的延長,腸上皮細胞中TNF-a、IL-1β表達水平呈增高趨勢。(4)LPS刺激8小時內(nèi),HT-29細胞組、A20基因沉默組、A20基因過表達組TNF-a表達水平存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=42.247；DF=2；P0.001)；(5)LPS刺激8小時內(nèi)不同時間點TNF-a表達水平存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=31.33；DF=5；P0.001)；且不同時間點TNF-a表達水平呈線性增高趨勢(F=111.435；DF=1；P0.001)(6)LPS刺激8小時內(nèi),HT-29細胞組、A20基因沉默組、A20基因過表達組IL-1β表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.456；DF=2；P=0.166)；(7)LPS刺激8小時內(nèi)不同時間點HT-29細胞組、A20基因沉默組、A20基因過表達組IL-1β表達水平存在差異(F=9.216；DF=5；P0.001),且呈線性增高趨勢(F=80.829；DF=1；P0.001)。 [結(jié)論]鋅指蛋白A20對腸上皮細胞炎癥反應(yīng)中起著重要的負性調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R574
【圖文】：

對照組△Ct值的均值計算出△△Ct;④計算出2△△C‘，即其余3組相對正常的變化倍數(shù)。熒光定量PCR反應(yīng)采用的引物序列見表3，擴增曲線圖和溶解曲線圖見圖1.

差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而A20表達水平明顯降低(下降10.9倍，尸<0.01)。工BD活動期組和非IBD腸炎組A20表達水平較正常對照組分別上調(diào)2.84倍(P<0.05)和6.40倍(P<0.05)，見表4圖2。表4組腸勃膜A20、IL一6、IL一 8mRNA表達水平(△Ct值)組別A20mRNAIL一6mRNAIL一smRNA正常對照組IBD緩解期組IBD活動期組非IBD腸炎組5.，l竺士 ().:3611.12士().2() 8.9()士().」()20士0.91士().65士 0.5097士().:弓26()士().92士0﨑

本文編號：2796467