【摘要】：研究背景及目的肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是原發(fā)性肝癌中最常見的形式,發(fā)病率居全球癌癥第六位,且全球超過一半的肝癌患病人群來自中國。肝癌通常預后極差,為癌癥相關死亡的第三大主要原因。大多數(shù)肝癌在慢性肝炎引起的嚴重肝纖維化和肝硬化基礎上發(fā)展而來。慢性肝炎病毒感染、酒精性肝病以及肝臟脂肪變性是肝硬化和肝癌的主要危險因素。由于肝癌發(fā)生的風險與肝臟疾病的背景因素密切相關,而肝纖維化則是肝臟疾病的主要病因之一,因此對于肝纖維化和肝癌發(fā)生發(fā)展機制的研究十分必要。天冬氨酰β-羥化酶(Aspartateβ-hydroxylase,ASPH)是一種α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶,其發(fā)現(xiàn)源于有乙肝病史的肝細胞癌患者細胞系(FOCUS),可特異催化體內(nèi)某些蛋白質(zhì)中存在的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(Epidermal growth factor-like domain)中天冬氨酸或天冬酰胺殘基上β碳原子的羥化反應,并發(fā)揮其生物學功能�，F(xiàn)階段關于ASPH的研究表明,ASPH在小細胞肺癌、結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤、肝細胞癌、膽管癌及胰腺癌患者的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達趨勢,并能夠影響腫瘤細胞的遷移能力和疾病進展。本課題組亦發(fā)現(xiàn),ASPH的表達量增高與肝細胞癌的腫瘤進展和臨床預后較差相關。同時,有研究發(fā)現(xiàn)ASPH通過糖原合成激酶3β調(diào)控細胞衰老從而促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。然而,現(xiàn)階段ASPH的研究主要集中在其他惡性腫瘤領域和肝癌的臨床和細胞層面,而在肝纖維化領域及肝癌的動物模型和尚無系統(tǒng)性的研究。前期工作中,本課題組發(fā)現(xiàn)肝癌患者的腫瘤組織中ASPH的表達量顯著高于癌旁組織,且肝纖維化組織中ASPH的表達亦顯著高于正常肝組織。同時,在二乙基亞硝胺(DEN)誘導的小鼠肝癌模型和四氯化碳(CCl_4)誘導的小鼠肝纖維化模型中也觀察到實驗組小鼠的ASPH表達量相較對照組顯著升高。因此,研究ASPH在肝癌和肝纖維化中的作用及其分子機制將有助于全面系統(tǒng)的認識該分子的生物學功能,并為ASPH這一分子靶點在肝病治療中的臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎。研究方法1.利用臨床組織樣本研究ASPH和肝纖維化及肝癌的關系:結(jié)合課題組已有的肝癌中ASPH表達水平和患者預后數(shù)據(jù),利用定量PCR檢測患者肝纖維化組織和正常肝組織中ASPH的表達水平,用ASPH的抗體進行免疫組化染色,在蛋白水平上檢測肝纖維化組織和對照肝組織中的ASPH表達,研究ASPH和肝纖維化及肝癌的關系。進一步將組織按照纖維化嚴重程度進行評分(Ishak評分系統(tǒng)),研究ASPH表達和肝纖維化程度的相關性。肝星形細胞(HSCs)是肝纖維化的主要效應細胞,我們通過免疫組化染色檢測組織中HSC活化的指標,如CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2、α-SMA和TGF-β1。同時采用免疫熒光法對組織進行α-SMA和ASPH的特異染色,以明確ASPH在HSC中的特異表達情況。2.利用小鼠疾病模型研究ASPH和肝纖維化及肝癌的關系:根據(jù)文獻報道方法,我們通過小鼠腹腔注射四氯化碳(CCl_4)和膽總管結(jié)扎分別誘導兩種肝纖維化模型,并通過腹腔注射二乙基亞硝胺(DEN)和四氯化碳(CCl_4)誘導肝癌模型。同時,我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)針對ASPH的His-2區(qū)域23外顯子進行敲除,成功建立了ASPH基因敲除(ASPH~(-/-))小鼠,通過肝組織染色比較敲除小鼠和野生型小鼠中肝纖維化和肝癌的組織病理變化,并在對ASPH敲除小鼠和野生型小鼠的肝纖維化和肝癌組織進行差異基因表達分析,用基因芯片技術(shù)檢測mRNA的變化,尋找差異表達的關鍵分子。同時,為了檢測抑制ASPH的功能是否影響小鼠肝纖維化和肝癌的發(fā)生和進展,我們在模型過程中同時給予小鼠注射ASPH的小分子抑制劑MO-I-1100,以驗證ASPH能否作為肝纖維化和肝癌治療的潛在靶點。3.利用肝星形細胞系研究ASPH對肝星形細胞活化和肝纖維化的影響:我們在HSC系Lx2中過表達ASPH,利用針對ASPH活性位點構(gòu)建的慢病毒特異性地敲除ASPH,并通過WB檢測ASPH的過表達和敲除水平,分析過表達和敲除ASPH后對肝星形細胞增殖、凋亡、遷移的影響。同時檢測其對細胞的活化指標CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2、α-SMA和TGF-β1表達的影響。4.統(tǒng)計學方法:數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標準差((?)±s)表示。多組間差異比較可采用One-way ANOVA法分析,Graphpad Prism 5.0軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和制圖。將P0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果1.本研究共收集34例肝纖維化組織樣本和36例正常肝組織樣本。相比于正常組織,肝纖維化組織中ASPH的表達顯著上升,進一步將肝纖維化組織評分發(fā)現(xiàn),ASPH表達和肝纖維化程度呈線性正相關關系。2.CCl_4或BDL誘導的肝纖維化模型以及DEN和CCL4誘導的肝癌模型均構(gòu)建成功。在兩種模型中,野生型小鼠肝臟組織中ASPH表達水平均明顯高于對照組和假手術(shù)組。同時,ASPH~(-/-)小鼠的肝硬化程度輕于野生型,表現(xiàn)為匯管區(qū)膠原沉積減少,纖維化指數(shù)較低,且肝臟組織中α-SMA、CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2和TGF-β1的表達水平較野生型小鼠組明顯降低;類似地,ASPH~(-/-)小鼠誘發(fā)肝癌的直徑大小、數(shù)量均顯著低于野生型小鼠。3.利用小干擾RNA(siRNA)下調(diào)HSC中ASPH的表達或使用ASPH抑制劑(MO-I-1100)后,HSC細胞的增殖、遷移受到顯著抑制,且肝纖維化效應分子表達顯著降低�；蛐酒瑱z測發(fā)現(xiàn),具有肝纖維化表型的野生型與ASPH~(-/-)小鼠相比,共有86個基因表達升高,259個基因表達降低,其中Cyp4a14基因差異倍數(shù)最大。選取Cyp4a14基因和通路驗證后發(fā)現(xiàn),ASPH~(-/-)小鼠中Cyp4a14顯著下調(diào)。通過siRNA下調(diào)HSC中Cyp4A14的表達后,HSC增殖、遷移均受到顯著抑制,且HSC活化的效應分子CollagenαⅠ和α-SMA的表達亦顯著降低。結(jié)論ASPH在肝纖維化患者和小鼠中表達升高,ASPH敲除后小鼠肝纖維化和肝癌的嚴重程度減輕。抑制ASPH時HSC的活化程度減低。Cyp4a14可能作為ASPH的下游分子,直接或通過視黃醇代謝通路參與HSC的活化。因此我們推斷,ASPH可以通過Cyp4a14/視黃醇代謝通路促進HSC活化從而促進肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575.2
【圖文】：

肝纖維化患者組織樣本中 ASPH 的表達量顯著高于正常對照（**，）縱坐標：ASPH 的相對表達量；橫坐標：正常肝組織對照組、肝。）ASPH 表達和肝纖維化程度正相關兩名病理學專業(yè)研究人員在盲法狀態(tài)下，根據(jù) Ishak 評分系統(tǒng)所提將肝纖維化患者 HE 染色后的組織切片進行肝纖維化分期（1-6 期現(xiàn)，肝纖維化組織中 ASPH 的表達量和肝纖維化 Ishak 分期呈線性圖 1.3）（R2= 0.897，P<0.001）。

海軍軍醫(yī)大學博士學位論文- 22 -圖1.3. 肝纖維化組織中ASPH的表達量和肝纖維化Ishak分期呈線性正相關關系（n = 34，R2= 0.897，P<0.001）縱坐標：ASPH 的相對表達量；橫坐標：Ishak評分區(qū)間。四、小結(jié)與討論本研究利用目前肝纖維化研究中較大病例樣本（n = 70）首次發(fā)現(xiàn)，ASPH在肝纖維化和肝硬化患者的肝臟組織中呈現(xiàn)高表達，且 ASPH 的表達量與肝纖維化的分期存在著線性正相關關系。該結(jié)果為本研究下一步在動物體內(nèi)和體外的實驗奠定了基礎。既往關于 ASPH 的研究多數(shù)聚焦于惡性腫瘤，其認為 ASPH 可影響腫瘤細胞的增殖和遷移能力，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)具有密切關系[15, 16, 18, 28-30]。在肝細胞癌患者中進行的外科學臨床研究中普遍認為，肝纖維化或肝硬化是肝癌術(shù)后復發(fā)的主要獨立危險因素之一[31, 32]。因此

SDS 美國 Sigma 公司TEMED 美國 Amresco 公司30%丙烯酰胺 美國 Sigma 公司BCA 蛋白檢測試劑盒 美國 Thermo 公司脫脂奶粉 伊利乳制品有限公司二、實驗方法（一）構(gòu)建 ASPH 酶活性敲除小鼠1、設計引導 RNA（gRNA）gRNA的目標序列為ASPH基因第23個外顯子的His-2區(qū)域），培育ASPH酶性敲除F0代小鼠（圖 2.1）：

【參考文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 武燁曄;天冬氨酰-（天冬酰胺酰）-β-羥化酶在肝纖維化進程中作用及機制的初步研究[D];福建醫(yī)科大學;2016年

本文編號：2796308