發(fā)布時間：2020-08-17 09:32

【摘要】： 慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)在我國是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的傳染性疾病，有近3500萬的CHB患者。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染慢性化及其持續(xù)感染機(jī)制尚未完全闡明，故而臨床上缺乏針對CHB的有效治療方法。HBV感染慢性化機(jī)制復(fù)雜，HBV感染時機(jī)體免疫功能低下以致不能有效清除病毒是主要原因。功能性T細(xì)胞損傷是HBV持續(xù)感染的重要特征。T細(xì)胞被激活需要雙刺激信號，均由抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)提供。巨噬細(xì)胞(macrophage，MΦ)和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是專職的APC，DC還能夠啟動初始T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。單核細(xì)胞(Monocyte，Mo)則是巨噬細(xì)胞(macrophage，MΦ)和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的前體細(xì)胞，在淋巴細(xì)胞的極化和增殖中發(fā)揮重要的作用，同時能夠決定人體與小鼠的初始及記憶性T細(xì)胞的反應(yīng)格局。 Mo不但在適應(yīng)性免疫中扮演重要角色，在固有免疫中也發(fā)揮重要作用。Mo具有多種Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)，如表面的TLR2和TLR4等，胞內(nèi)有TLR3等受體表達(dá)，能夠感知外來抗原。細(xì)胞外信號可以被轉(zhuǎn)換成胞內(nèi)的生化事件，引起基因的轉(zhuǎn)錄激活和產(chǎn)物表達(dá)。單核細(xì)胞發(fā)揮作用除了可以通過細(xì)胞的直接作用或表面受體外，還可以分泌相關(guān)的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukine-6，IL-6)、IL-10和IL-12等。目前對Mo的研究正處于起步階段；國內(nèi)外都缺乏有關(guān)HBV慢性感染時Mo的系統(tǒng)性研究資料。因此，了解Mo的功能狀態(tài)非常必要。 本課題中，我們以Mo與HBV慢性感染時機(jī)體免疫功能低下的相關(guān)性為研究目的，從Mo對抗原感知，免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)三個階段開展研究。 第一部分慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞亞群及TLR表達(dá)分析 目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞的比例、CD14~(low)CD16~+亞群及表面TLR2、TLR4的表達(dá)量，探討單核細(xì)胞的CD14~(low)CD16~+亞群及TLR與HBV慢性感染之間的相關(guān)性。 方法 設(shè)立慢乙肝組(CHB組)和正常對照組(N組)。在慢乙肝組中篩選慢性乙型肝炎患者20例，未經(jīng)任何抗病毒或免疫調(diào)節(jié)劑治療，除外其他肝臟疾病及自身免疫性疾��；對照組中以12例健康者作對照。取外周抗凝血1ml，用流式細(xì)胞儀測定外周血Mos及CD14~(low)CD16~+亞群的比例和TLR2、TLR4的表達(dá)量。 結(jié)果 慢性乙型肝炎患者外周血中Mo的比例為8.53±2.39％，較之對照組的6.22±1.16％有明顯增高(P＜0.05)。Mo亞群CD14lowCD16+在總Mo中所占的比例為14.56±7.31％，明顯高于對照組的10.47±4.80％(P＜0.05)； 慢乙肝組中表達(dá)TLR2的Mo比例為77.15±13.78％，平均熒光密度(mean flurescence intensity，MFI)為1358.12±612.49；對照組TLR2的Mo陽性率為77.02±8.31％，MFI為1322.15±251.02，兩組比較無顯著差異(p＞0.05)；慢乙肝組Mo的TLR4陽性率為76.88±10.27％，MFI 700.9±428.75；對照組的Mo TLR4陽性率是77.84±6.25％，MFI為614.0±235.64。兩組之間比較TLR4的Mo陽性細(xì)胞表達(dá)率及MFI進(jìn)行比較，顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。 結(jié)論 1．慢乙肝患者的外周血Mo比例及亞群CD14lowCD16+比例明顯升高，提示單核細(xì)胞與HBV慢性感染有相關(guān)性； 2．慢乙肝患者外周血Mo表面的TLR2和TLR4的表達(dá)并沒有明顯改變，提示Mo的TLR2和TLR4可能與HBV的慢性進(jìn)展關(guān)聯(lián)較小。 第二部分慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞的B7-H1及CD155轉(zhuǎn)錄水平的分析 目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞中，B7-H1和CD155的mRNA表達(dá)水平變化，探討單核細(xì)胞在慢乙肝患者T細(xì)胞功能缺陷中的作用。 方法 設(shè)立CHB組和N組。在CHB組中篩選慢性乙型肝炎患者16例，未經(jīng)任何抗病毒或免疫調(diào)節(jié)劑治療，除外其他肝臟疾病及自身免疫性疾��；N組中以10例健康者作對照。從患者外周血中分離出單核細(xì)胞，以脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激，分別在刺激后0h、6h和24h收集細(xì)胞，制備總RNA，以Real-time PCR方法檢測B7-H1和CD155 mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 慢性乙型肝炎患者M(jìn)o在LPS刺激前，B7-H1 mRNA量為0.85±0.14，對照組在刺激前Mo的B7-H1 mRNA量為1.35±0.28，兩組之間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。LPS刺激6h后，慢乙肝組的B7-H1 mRNA量上升至1709±598.9，對照組則升至3179 1015，兩組之間比較無明顯差異(p＞0.05)；LPS刺激后24h，慢乙肝組的B7-H1 mRNA量是1271±492.3，而對照組的mRNA量是1716±535.84，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。 慢性乙型肝炎患者M(jìn)o在LPS刺激后6h，BT-H1的mRNA表達(dá)水平較刺激前有明顯升高，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但24h后未有繼續(xù)升高；對照組的mRNA表達(dá)水平在LPS刺激后6h較刺激前有明顯上升，差異具有顯著性(p＜0.05)，但是，刺激24h后B7-H1的mRNA表達(dá)水平有明顯下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)； 慢性乙型肝炎患者M(jìn)o在LPS刺激前，CD155 mRNA量為1.52±0.49，對照組在刺激前，MoCD155的mRNA量為1.34±0.30，兩組之間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)；LPS刺激后6h，慢乙肝組的CD155 mRNA量為1.97±0.41，而對照組為1.31±0.09，兩組無明顯差異(p＞0.05)；LPS刺激后24h，慢乙肝組的CD155mRNA量為3.56±0.14，對照組為6.30±1.30，比較無差異(p＞0.05)。 慢性乙型肝炎患者M(jìn)o在LPS刺激后6h，CD155的mRNA表達(dá)水平較刺激前無明顯變化，但是刺激24h后，CD155 mRNA的表達(dá)顯著升高，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；正常對照組中Mo的CD155 mRNA水平，在LPS刺激后6h較刺激前無明顯變化(p＜0.05)，但在刺激24h后，CD155的mRNA水平有明顯升高，差異具有顯著性(p＜0.05)。 結(jié)論 1．提示B7-H1和CD155與T細(xì)胞的功能受抑制無明顯相關(guān)性； 2．B7-H1和CD155為T細(xì)胞抑制性受體的配體，在LPS的刺激后表現(xiàn)為特征各異的時序性，可能是在不同的階段發(fā)揮作用。 第三部分慢乙肝患者外周血單核細(xì)胞LPS刺激后功能分析 目的 研究觀察慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞在LPS刺激后，分泌TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12的情況，探討單核細(xì)胞在HBV慢性感染時炎癥反應(yīng)能力及對T細(xì)胞功能的影響。 方法 設(shè)立CHB組和N組。CHB組中篩選慢性乙型肝炎患者16例，未經(jīng)任何抗病毒或免疫調(diào)節(jié)劑治療，排除其他肝臟疾病及自身免疫性疾��；N組中以10例健康者作對照。從外周血中分離出單核細(xì)胞，以LPS刺激，刺激后0h、6h及24h分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA方法檢測不同時間點(diǎn)TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12的濃度。 結(jié)果 1．TNF-α的ELISA結(jié)果： 1．1．兩組間比較：LPS刺激前，CHB組TNF-α濃度為38.83±7.69 pg／ml，N組是35.40±7.72 pg／ml，兩組間沒有明顯差異(p＞0.05)；刺激后6h，CHB組濃度升至5654±1350 pg／ml，N組為10320±51.05 pg／ml，N組顯著高于CHB組(p＜0.05)；刺激后24h，CHB組TNF-α濃度為6384±175.9 pg／ml，N組是14770±780.0 pg／ml，明顯高于CHB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)； 1．2．不同時間點(diǎn)的比較：CHB組中，LPS刺激后6h的TNF-α濃度顯著高于LPS刺激前(p＜0.05)；N組中，LPS刺激后6h的TNF-α濃度也顯著高于刺激前(p＜0.05)，刺激后24h的濃度較刺激后6h有顯著升高(p＜0.05)。 2．IL-6的ELISA結(jié)果： 2．1．兩組間比較：LPS刺激前，CHB組的濃度為1.804±0.60 pg／ml，N組是1.103±0.76 pg／ml，兩組之間沒有顯著差異(p＞0.05)；刺激后6h，CHB組的IL-6濃度升至1133±68.91 pg／ml，N組為1069±26.93 pg／ml，兩組差異不顯著(p＞0.05)；刺激后24h，CHB組IL-6濃度為1084±11.81 pg／ml，N組的濃度是1600±16.79 pg／ml，對照組明顯高于CHB組，差異有顯著性(p＜0.05)； 2．2．不同時間點(diǎn)的比較：慢乙肝組中，LPS刺激后6h的IL-6濃度明顯高于LPS刺激前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；對照組中LPS刺激后6h的IL-6濃度明顯高于刺激前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，LPS刺激后24h的IL-6濃度較刺激后6h的濃度也有顯著升高(p＜0.05)。 3．IL-10的ELISA結(jié)果： 3．1．兩組間比較：LPS刺激前，CHB組的濃度為4.61±2.01 pg／ml，N組是13.14±4.39 pg／ml，兩組之間沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)；刺激后6h，CHB組的IL-10濃度升至380.4±66.4 pg／ml，N組則為861.4±157.8 pg／ml，對照組明顯高于慢乙肝組(p＜0.05)；刺激后24h，CHB組IL-10濃度為4241±914pg／ml，N組的濃度是2214±557.2 pg／ml，組間比較無差異(p＞0.05)； 3．2．不同時間點(diǎn)的比較：慢乙肝組中，LPS刺激后6h濃度明顯高于刺激前(p＜0.05)，LPS刺激后24h的IL-10濃度明顯高于刺激后6h(p＜0.05)；正常對照組中，LPS刺激后6h的IL-10濃度明顯高于LPS刺激前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，刺激后24h的濃度較刺激后6h的濃度也有顯著升高(p＜0.05)。 4．IL-12的ELISA結(jié)果： 4．1．兩組間比較：LPS刺激前，CHB組的濃度為8.87±1.70 pg／ml，N組是9.78±0.65 pg／ml，組間比較無差異(p＞0.05)；刺激后6h，CHB組的IL-12濃度升至21.40±2.96 pg／ml，N組則為21.70±13.23 pg／ml，組間比較無差異(p＞0.05)；刺激后24h，CHB組IL-12濃度為11.03±0.37 pg／ml，N組的濃度是16.80±1.56 pg／ml，組間比較無差異(p＞0.05)； 4．2．不同時間點(diǎn)的比較：慢乙肝組中，LPS刺激后6h的IL-12濃度明顯高于LPS刺激前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；對照組中，LPS刺激后6h的IL-10濃度明顯高于刺激前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。 結(jié)論 1．LPS刺激后，單核細(xì)胞有TNF-α、IL-6、IL-10分泌，且呈時間依賴性； 2．單核細(xì)胞受LPS誘導(dǎo)后有IL-12分泌，在刺激6h后達(dá)高峰； 3．HBV慢性感染時，單核細(xì)胞功能有障礙，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞因子分泌的減少。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62
【圖文】：

在流式儀上，根據(jù)顆粒度(SSC)及細(xì)胞大小(FSC)，可以將外周血中的白細(xì)胞分為二大群，自上而下依次為中性粒細(xì)胞(SSC最大)、單核細(xì)胞(SSC居中)和淋巴細(xì)胞(SSC最小)(圖1一1a)。以方框圈定待測的單核細(xì)胞(圖1一lb中的P1)，以備下一步的檢測，數(shù)據(jù)顯示單核細(xì)胞約占白細(xì)胞總數(shù)的6%(見圖1一1)。NNNNNNNNNNNNNNNNN·TU匕 e00222……嘴畜 ----{OOOJ:謀之:〕、:二及皿........口兄只， ).PP!仍仍悶劣)了·?·萬、，邢碩口......丙祝窗分、卜 ...。。(腳黔一…，‘.， :{{{幼 幼1的，佃洲】2鈞 鈞 FFFSC一A今1.咖 )))NNNNNNNNNNNNNNNNNNN一TU匕8800222222222222222222222222222…… 咬飛、·廠少3高山二.飛牡嘴硯價從了.少’氣 氣氣.....:::、、飛灘，戶沁倉已七;1孚沙越獲多價卜獷少 :的的………筍 FSC一A(x

以未加任何抗體的細(xì)胞為陰性對照，確定CD14抗體未標(biāo)記細(xì)胞的陰性范圍(如圖Za所示Q3一6)，以Perep/eys.5熒光素標(biāo)記的CD14抗體分選出陽性單核細(xì)胞(如圖2b所示Ql一6)，結(jié)果顯示單核細(xì)胞的比例約900/0。(見圖1一2)。耽耽耽耽耽耽耽耽耽耽耽 耽卜 Nlll一一全廠萬弓習(xí)QZ· 66666月月‘三側(cè) 1.............的的日 3---15Q41一 66666空空 1}}}}}}}}}}}}}}}}}}}甲甲 ._1}}}}幾幾呈習(xí)01石Q夕· 6111望望月一 r---...田田1月 ...QQQ-心攘巧習(xí) 習(xí)刁 刁了 0tD一tD一 1010--- PPPE一 AAAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCh· Cd1444::::矛習(xí) !!!弓QZ· 66666】】、l，習(xí)肥硯乙l，， ，甲甲。1遙必 1Q41一 66666幾幾旦悶，加汾01書O，.只 lll甕甕一到拼、一[一 lllDDD-尸藝刻李，彬 彬 PPPE一 AAA圖1一 2Percp/cys.5熒光素標(biāo)記的cD14抗體分選出陽性單核細(xì)胞a.CD14熒光抗體未標(biāo)記的單核細(xì)胞群(Q3一6);b.CD14熒光抗體標(biāo)記陽性的單核細(xì)胞群(Ql一6)，顯示陽性細(xì)胞比例約為90%。2.3.通過CD14抗體及CD16抗體雙標(biāo)記

以未加任何抗體的細(xì)胞為陰性對照，確定CD14抗體未標(biāo)記細(xì)胞的陰性范圍(如圖Za所示Q3一6)，以Perep/eys.5熒光素標(biāo)記的CD14抗體分選出陽性單核細(xì)胞(如圖2b所示Ql一6)，結(jié)果顯示單核細(xì)胞的比例約900/0。(見圖1一2)。耽耽耽耽耽耽耽耽耽耽耽 耽卜 Nlll一一全廠萬弓習(xí)QZ· 66666月月‘三側(cè) 1.............的的日 3---15Q41一 66666空空 1}}}}}}}}}}}}}}}}}}}甲甲 ._1}}}}幾幾呈習(xí)01石Q夕· 6111望望月一 r---...田田1月 ...QQQ-心攘巧習(xí) 習(xí)刁 刁了 0tD一tD一 1010--- PPPE一 AAAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCh· Cd1444::::矛習(xí) !!!弓QZ· 66666】】、l，習(xí)肥硯乙l，， ，甲甲。1遙必 1Q41一 66666幾幾旦悶，加汾01書O，.只 lll甕甕一到拼、一[一 lllDDD-尸藝刻李，彬 彬 PPPE一 AAA圖1一 2Percp/cys.5熒光素標(biāo)記的cD14抗體分選出陽性單核細(xì)胞a.CD14熒光抗體未標(biāo)記的單核細(xì)胞群(Q3一6);b.CD14熒光抗體標(biāo)記陽性的單核細(xì)胞群(Ql一6)，顯示陽性細(xì)胞比例約為90%。2.3.通過CD14抗體及CD16抗體雙標(biāo)記

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張隨濤;疏肝健脾解毒法對慢性乙型病毒性肝炎（肝郁脾虛挾濕熱證）IFN-γ影響的臨床研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2012年

本文編號：2795144