【摘要】：目的腸道微生物數(shù)目大,類別繁多,相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道人體消化系統(tǒng)內(nèi)大約定植10萬億微生物,約由400-500種細(xì)菌組成,大多數(shù)定植于小腸及大腸的不同節(jié)段。正常條件下腸道菌群在機(jī)體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)穩(wěn)定平衡狀態(tài),不同種類細(xì)菌之間互相作用,起到促進(jìn)宿主胃腸發(fā)育及動(dòng)力、調(diào)節(jié)免疫及能量代謝,同時(shí)還可抵抗致病菌定植等作用。研究發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致宿主胃腸動(dòng)力發(fā)生異常,但其具體作用機(jī)制及途徑并未闡明。臨床研究發(fā)現(xiàn)便秘病人的腸道菌群在菌落等各個(gè)類別中,與健康人存在顯著差異,如便秘人群中腸黏膜菌群擬桿菌屬豐富度增加,乳酸桿菌及雙歧桿菌含量減少。同時(shí)大量研究證實(shí)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)為由嗜鉻細(xì)胞合成并分泌于腸道的重要神經(jīng)遞質(zhì);5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter,SERT)則是廣泛分布于腸上皮細(xì)胞的一種跨膜蛋白,兩者相互作用調(diào)整腸道運(yùn)動(dòng)及內(nèi)臟敏感性,而腸道環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞可影響SERT表達(dá)及腸道動(dòng)力。本研究擬建立腸道菌群消耗模型后分別予小鼠移植不同人群的腸道菌群,進(jìn)而評(píng)價(jià)宿主的胃腸動(dòng)力改變、腸道組織中中SERT表達(dá)差異、腸道動(dòng)力相關(guān)蛋白及宿主腸道菌群改變,主要為進(jìn)一步闡述腸道菌群失調(diào)促進(jìn)慢性便秘發(fā)生發(fā)展過程的可能機(jī)制研究。方法參照既往文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)采集糞便樣本。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):購入20只6周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為FMT-H組(FMT-H:the group that received the fecal microbiota of healthy;予健康人群糞菌液灌胃干預(yù))和FMT-C組(FMT-C:the group that received the fecal microbiota of constipation patients;予便秘人群糞菌液灌胃干預(yù)),先連續(xù)3天予抗生素雞尾酒法(包括500 mg氨芐西林、250 mg萬古霉素、500 mg新霉素及250 mg甲硝唑)灌胃處理,建立腸道菌群消耗模型,兩組每只模型小鼠每次250 ul(濃度為1:10 g/ml)糞菌液灌胃干預(yù),4-6天連續(xù)灌胃,后每間隔一天處理1次,繼續(xù)處理4次,總實(shí)驗(yàn)共為15天。分別檢測(cè)不同時(shí)間段內(nèi)小鼠排便參數(shù);實(shí)驗(yàn)結(jié)束后殺死小鼠,取出并沖洗結(jié)腸組織,于10%福爾馬林及-80℃保存。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):在37℃及5%二氧化碳條件下,培養(yǎng)基(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle Medium、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸及微量抗真菌藥)培養(yǎng)人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞),生長至70-80%,予饑餓處理12-14小時(shí),分別予不同糞菌液刺激3小時(shí)(糞菌液:培養(yǎng)基=1:2000),裂解細(xì)胞后儲(chǔ)存于-80℃。采用Realtime-PCR和Western blot方法評(píng)估不同樣本組織中SERT mRNA、MUC 2 mRNA及SERT蛋白表達(dá)情況;采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定小鼠結(jié)腸組織中5-HT相對(duì)含量;采用免疫熒光染色方法評(píng)價(jià)結(jié)腸組織中5-HT陽性細(xì)胞量、嗜鉻細(xì)胞陽性數(shù)量及肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(transgelin)表達(dá)水平;模型建立后的小鼠腸道菌群多樣性、豐富度及菌群各個(gè)級(jí)別采用16S rRNA焦磷酸測(cè)序方法數(shù)量化;運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法及過碘酸雪夫氏(Periodic Acid-Schiff,PAS)方法評(píng)價(jià)小鼠結(jié)腸MUC2細(xì)胞及潘氏細(xì)胞數(shù)量,探究腸道菌群失調(diào)在慢性便秘發(fā)生及發(fā)展中可能機(jī)制。結(jié)果1、未予任何處理的野生型小鼠排便參數(shù):2小時(shí)排便頻率12.6±2.51粒;糞便濕重301.8±33.8 mg;糞便干重119.3±37.2 mg;糞便含水率60.5±10.1%。實(shí)驗(yàn)第7天小鼠排便參數(shù)顯示,FMT-C組小鼠2h排便頻率(13.65±3.11 vs 15.39±2.58粒,P0.05)、糞便重量(225.2±46.45 mg vs 269.86±32.66 mg,P0.05)、糞便干重(114.72±29.94 mg vs 134.89±25.15 mg,P0.05)、糞便含水率(48.76%±6.12%vs 50.46%±5.38%,,P0.05)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且與未經(jīng)干預(yù)的小鼠的排便參數(shù)相比無明顯改變(P0.05)。實(shí)驗(yàn)第15天排便參數(shù)結(jié)果示,FMT-C組小鼠2h排便頻率顯著減慢(8.48±1.78 vs 12.12±2.89粒,P0.05),糞便重量減輕(151.88±32.32 mg vs 246.68±63.89 mg,P0.01),糞便干重降低(65.49±11.74 mg vs 92.91±23.04 mg,P0.05),糞便含水率減少(56.61%±3.01%vs 61.92%±3.68%,P0.05),與未經(jīng)干預(yù)的小鼠相比,FMT-C組小鼠糞便重量、干重及含水率顯著降低,排便頻率減慢(P0.05),而FMT-H組小鼠的排便參數(shù)有下降趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、實(shí)驗(yàn)第15天,FMT-C組小鼠胃腸排空時(shí)間較FMT-H組明顯延長(83.24±11.31min vs 69±2.72 min,P0.05);此外,本研究通過免疫熒光方法發(fā)現(xiàn),transgelin蛋白含量在FMT-C組小鼠結(jié)腸組織中相對(duì)表達(dá)下降。3、SERT mRNA相對(duì)表達(dá)水平在兩組結(jié)腸組織中比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),FMT-C組顯著增高(P0.05);其SERT蛋白含量與mRNA增高結(jié)果一致(P0.05)。同時(shí),體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),便秘患者糞菌液可上調(diào)Caco-2細(xì)胞中SERT的表達(dá)含量。4、ELISA方法分析顯示,FMT-C組小鼠結(jié)腸組織中5-HT水平較FMT-H組顯著下降(151.59±10.15 vs 198.68±25.94 ng/ml,P0.01);此外,5-HT水平與胃腸排空時(shí)間呈負(fù)相關(guān);熒光染色結(jié)果顯示,FMT-C組腸道組織中5-HT的陽性表達(dá)數(shù)量較FMT-H組明顯減少(P0.05),FMT-C組嗜鉻細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)量表達(dá)有減少的趨勢(shì),但減少程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5、通過16S rRNA菌群測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)兩組模型小鼠的腸道菌群存在顯著差異。在門水平上,FMT-C組糞便中厚壁菌門所占比例降低,擬桿菌門升高;在菌屬水平上,梭菌屬、乳酸菌屬、脫硫弧菌屬、產(chǎn)甲烷菌屬水平降低,而擬桿菌屬和Akkermansia菌屬明顯增多。6、通過PCR及免疫組化方法評(píng)價(jià)小鼠腸道化學(xué)屏障功能:FMT-C組小鼠結(jié)腸中粘蛋白MUC-2 mRNA水平、杯狀細(xì)胞及MUC-2細(xì)胞陽性表達(dá)均下降。結(jié)論腸道菌群失調(diào)通過增加小鼠腸道組織中SERT表達(dá)、促進(jìn)5-HT再攝取及終止其功能和抑制腸道平滑肌收縮等作用促進(jìn)慢性便秘的發(fā)生及發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R574.62
【圖文】：

醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、對(duì)象2 動(dòng)物分組、干預(yù)及組織標(biāo)本留取方法動(dòng)物隨機(jī)分為每組 10 只，共 2 組，予抗生素雞尾酒連續(xù)灌胃 3 天，構(gòu)群消耗模型[22]。FMT-C 組予便秘人群糞菌液灌胃干預(yù)，F(xiàn)MT-H 組予健群糞菌液灌胃干預(yù)。糞菌液選擇劑量及灌菌頻率根據(jù)文獻(xiàn)制定[23-25]。實(shí) 15 天，分別于不同時(shí)間段（第 7 天和第 15 天）檢測(cè)胃腸排空時(shí)間、率、2h 糞便重量、2h 糞便干重及糞便含水率，最后處死小鼠，逐層解腸道，留取結(jié)腸組織，用冰 PBS 緩沖液沖洗腸道壁內(nèi)側(cè)后縱形剖開，一半結(jié)腸組織液氮暫時(shí)保存，剩余結(jié)腸沿腸道橫軸卷起，用針固定并福爾馬林液中并標(biāo)記。（流程圖見圖 1）

位論文 小鼠排便參數(shù)的影響（A 空白對(duì)照組、FMT-H組、FMT-H 組及 FMT-C 組糞便重量的變化；重的變化；D 空白對(duì)照組、FMT-H 組及 FMT-C調(diào)促使小鼠腸道動(dòng)力異常的胃腸排空時(shí)間較 FMT-H 組明顯延長（8.05）；同時(shí)，共聚焦熒光染色顯示 FMT-C達(dá)量低于 FMT-H 組。見圖 4 及圖 5；

腸道菌群失調(diào)促使小鼠腸道動(dòng)力異常MT-C 組小鼠的胃腸排空時(shí)間較 FMT-H 組明顯延長（83.24±11.31mi72 min，P< 0.05）；同時(shí)，共聚焦熒光染色顯示 FMT-C 組小鼠結(jié)腸sgelin 蛋白表達(dá)量低于 FMT-H 組。見圖 4 及圖 5；組胃腸傳輸時(shí)間（FMT-H 組：予健康成人糞菌液；FMT-C 組：予便秘成人糞

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本文編號(hào)：2793770