【摘要】：目的腸道微生物數(shù)目大,類別繁多,相關文獻報道人體消化系統(tǒng)內(nèi)大約定植10萬億微生物,約由400-500種細菌組成,大多數(shù)定植于小腸及大腸的不同節(jié)段。正常條件下腸道菌群在機體內(nèi)處于動態(tài)穩(wěn)定平衡狀態(tài),不同種類細菌之間互相作用,起到促進宿主胃腸發(fā)育及動力、調(diào)節(jié)免疫及能量代謝,同時還可抵抗致病菌定植等作用。研究發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡會導致宿主胃腸動力發(fā)生異常,但其具體作用機制及途徑并未闡明。臨床研究發(fā)現(xiàn)便秘病人的腸道菌群在菌落等各個類別中,與健康人存在顯著差異,如便秘人群中腸黏膜菌群擬桿菌屬豐富度增加,乳酸桿菌及雙歧桿菌含量減少。同時大量研究證實5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)為由嗜鉻細胞合成并分泌于腸道的重要神經(jīng)遞質(zhì);5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter,SERT)則是廣泛分布于腸上皮細胞的一種跨膜蛋白,兩者相互作用調(diào)整腸道運動及內(nèi)臟敏感性,而腸道環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞可影響SERT表達及腸道動力。本研究擬建立腸道菌群消耗模型后分別予小鼠移植不同人群的腸道菌群,進而評價宿主的胃腸動力改變、腸道組織中中SERT表達差異、腸道動力相關蛋白及宿主腸道菌群改變,主要為進一步闡述腸道菌群失調(diào)促進慢性便秘發(fā)生發(fā)展過程的可能機制研究。方法參照既往文獻標準采集糞便樣本。動物實驗:購入20只6周齡SPF級C57BL/6小鼠隨機分為FMT-H組(FMT-H:the group that received the fecal microbiota of healthy;予健康人群糞菌液灌胃干預)和FMT-C組(FMT-C:the group that received the fecal microbiota of constipation patients;予便秘人群糞菌液灌胃干預),先連續(xù)3天予抗生素雞尾酒法(包括500 mg氨芐西林、250 mg萬古霉素、500 mg新霉素及250 mg甲硝唑)灌胃處理,建立腸道菌群消耗模型,兩組每只模型小鼠每次250 ul(濃度為1:10 g/ml)糞菌液灌胃干預,4-6天連續(xù)灌胃,后每間隔一天處理1次,繼續(xù)處理4次,總實驗共為15天。分別檢測不同時間段內(nèi)小鼠排便參數(shù);實驗結束后殺死小鼠,取出并沖洗結腸組織,于10%福爾馬林及-80℃保存。細胞實驗:在37℃及5%二氧化碳條件下,培養(yǎng)基(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle Medium、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸及微量抗真菌藥)培養(yǎng)人結腸癌上皮細胞(Caco-2細胞),生長至70-80%,予饑餓處理12-14小時,分別予不同糞菌液刺激3小時(糞菌液:培養(yǎng)基=1:2000),裂解細胞后儲存于-80℃。采用Realtime-PCR和Western blot方法評估不同樣本組織中SERT mRNA、MUC 2 mRNA及SERT蛋白表達情況;采用酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠結腸組織中5-HT相對含量;采用免疫熒光染色方法評價結腸組織中5-HT陽性細胞量、嗜鉻細胞陽性數(shù)量及肌動蛋白結合蛋白(transgelin)表達水平;模型建立后的小鼠腸道菌群多樣性、豐富度及菌群各個級別采用16S rRNA焦磷酸測序方法數(shù)量化;運用免疫組織化學染色方法及過碘酸雪夫氏(Periodic Acid-Schiff,PAS)方法評價小鼠結腸MUC2細胞及潘氏細胞數(shù)量,探究腸道菌群失調(diào)在慢性便秘發(fā)生及發(fā)展中可能機制。結果1、未予任何處理的野生型小鼠排便參數(shù):2小時排便頻率12.6±2.51粒;糞便濕重301.8±33.8 mg;糞便干重119.3±37.2 mg;糞便含水率60.5±10.1%。實驗第7天小鼠排便參數(shù)顯示,FMT-C組小鼠2h排便頻率(13.65±3.11 vs 15.39±2.58粒,P0.05)、糞便重量(225.2±46.45 mg vs 269.86±32.66 mg,P0.05)、糞便干重(114.72±29.94 mg vs 134.89±25.15 mg,P0.05)、糞便含水率(48.76%±6.12%vs 50.46%±5.38%,,P0.05)無統(tǒng)計學差異,且與未經(jīng)干預的小鼠的排便參數(shù)相比無明顯改變(P0.05)。實驗第15天排便參數(shù)結果示,FMT-C組小鼠2h排便頻率顯著減慢(8.48±1.78 vs 12.12±2.89粒,P0.05),糞便重量減輕(151.88±32.32 mg vs 246.68±63.89 mg,P0.01),糞便干重降低(65.49±11.74 mg vs 92.91±23.04 mg,P0.05),糞便含水率減少(56.61%±3.01%vs 61.92%±3.68%,P0.05),與未經(jīng)干預的小鼠相比,FMT-C組小鼠糞便重量、干重及含水率顯著降低,排便頻率減慢(P0.05),而FMT-H組小鼠的排便參數(shù)有下降趨勢,但無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、實驗第15天,FMT-C組小鼠胃腸排空時間較FMT-H組明顯延長(83.24±11.31min vs 69±2.72 min,P0.05);此外,本研究通過免疫熒光方法發(fā)現(xiàn),transgelin蛋白含量在FMT-C組小鼠結腸組織中相對表達下降。3、SERT mRNA相對表達水平在兩組結腸組織中比較結果發(fā)現(xiàn),FMT-C組顯著增高(P0.05);其SERT蛋白含量與mRNA增高結果一致(P0.05)。同時,體外實驗證實,便秘患者糞菌液可上調(diào)Caco-2細胞中SERT的表達含量。4、ELISA方法分析顯示,FMT-C組小鼠結腸組織中5-HT水平較FMT-H組顯著下降(151.59±10.15 vs 198.68±25.94 ng/ml,P0.01);此外,5-HT水平與胃腸排空時間呈負相關;熒光染色結果顯示,FMT-C組腸道組織中5-HT的陽性表達數(shù)量較FMT-H組明顯減少(P0.05),FMT-C組嗜鉻細胞陽性細胞數(shù)量表達有減少的趨勢,但減少程度無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5、通過16S rRNA菌群測序方法發(fā)現(xiàn)兩組模型小鼠的腸道菌群存在顯著差異。在門水平上,FMT-C組糞便中厚壁菌門所占比例降低,擬桿菌門升高;在菌屬水平上,梭菌屬、乳酸菌屬、脫硫弧菌屬、產(chǎn)甲烷菌屬水平降低,而擬桿菌屬和Akkermansia菌屬明顯增多。6、通過PCR及免疫組化方法評價小鼠腸道化學屏障功能:FMT-C組小鼠結腸中粘蛋白MUC-2 mRNA水平、杯狀細胞及MUC-2細胞陽性表達均下降。結論腸道菌群失調(diào)通過增加小鼠腸道組織中SERT表達、促進5-HT再攝取及終止其功能和抑制腸道平滑肌收縮等作用促進慢性便秘的發(fā)生及發(fā)展。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62
【圖文】：

醫(yī)科大學碩士學位論文 一、對象2 動物分組、干預及組織標本留取方法動物隨機分為每組 10 只，共 2 組，予抗生素雞尾酒連續(xù)灌胃 3 天，構群消耗模型[22]。FMT-C 組予便秘人群糞菌液灌胃干預，F(xiàn)MT-H 組予健群糞菌液灌胃干預。糞菌液選擇劑量及灌菌頻率根據(jù)文獻制定[23-25]。實 15 天，分別于不同時間段（第 7 天和第 15 天）檢測胃腸排空時間、率、2h 糞便重量、2h 糞便干重及糞便含水率，最后處死小鼠，逐層解腸道，留取結腸組織，用冰 PBS 緩沖液沖洗腸道壁內(nèi)側(cè)后縱形剖開，一半結腸組織液氮暫時保存，剩余結腸沿腸道橫軸卷起，用針固定并福爾馬林液中并標記。（流程圖見圖 1）

位論文 小鼠排便參數(shù)的影響（A 空白對照組、FMT-H組、FMT-H 組及 FMT-C 組糞便重量的變化；重的變化；D 空白對照組、FMT-H 組及 FMT-C調(diào)促使小鼠腸道動力異常的胃腸排空時間較 FMT-H 組明顯延長（8.05）；同時，共聚焦熒光染色顯示 FMT-C達量低于 FMT-H 組。見圖 4 及圖 5；

腸道菌群失調(diào)促使小鼠腸道動力異常MT-C 組小鼠的胃腸排空時間較 FMT-H 組明顯延長（83.24±11.31mi72 min，P< 0.05）；同時，共聚焦熒光染色顯示 FMT-C 組小鼠結腸sgelin 蛋白表達量低于 FMT-H 組。見圖 4 及圖 5；組胃腸傳輸時間（FMT-H 組：予健康成人糞菌液；FMT-C 組：予便秘成人糞

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本文編號：2793770