【摘要】：目的:原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis,PBC)是一種以肝內(nèi)小膽管非化膿性炎癥破壞,肝小葉匯管區(qū)炎癥,慢性膽汁淤積為特點(diǎn)的自身免疫性肝病。研究表明壞死性凋亡在PBC的發(fā)病中扮演了重要角色,但其調(diào)控機(jī)制仍不明確。熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)可以調(diào)節(jié)壞死性凋亡,且在多種肝病的發(fā)病中起重要作用。本研究旨在明確HSP90在PBC的發(fā)病中的表達(dá)水平變化,探究干預(yù)HSP90對(duì)PBC小鼠疾病進(jìn)程的影響。進(jìn)而闡明HSP90是否通過(guò)調(diào)節(jié)壞死性凋亡影響PBC的進(jìn)程。方法:將6周齡雌性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為以下5組:正常對(duì)照組、PBC組、PBC+2.5mg/Kg 17-DMAG治療組、PBC+5mg/Kg 17-DMAG治療組和PBC+10mg/Kg17-DMAG治療組。對(duì)造模組小鼠,分別于第1天和第15天腹腔注射100μg的2OA-BSA。第三天開(kāi)始,每三天腹腔注射一次Poly I:C(5 mg/kg),建立PBC動(dòng)物模型。治療組在造模的同時(shí)隔日腹腔注射一次17-DMAG進(jìn)行治療。正常對(duì)照組每次腹腔注射等體積PBS。8周后處死小鼠,將小鼠血清及肝臟標(biāo)本留存。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清中抗PDC-E2抗體和IL-6、IFN-γ、TNF-α水平。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)肝臟促炎細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ、MCP-1的水平。蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)HSP90、RIP1、RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL蛋白水平。HE染色觀(guān)察肝臟組織炎癥程度。免疫組化(IHC)檢測(cè)HSP90的表達(dá)。結(jié)果:(1)小鼠肝臟HE染色可見(jiàn)PBC模型組匯管區(qū),尤其是受損的小葉間膽管周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)。血清中抗PDC-E2抗體滴度明顯升高。證明PBC小鼠模型建立成功。(2)IHC和Western blotting結(jié)果顯示HSP90在PBC小鼠的肝臟中表達(dá)較正常對(duì)照組升高。(3)抑制HSP90降低了PBC小鼠血清中抗PDC-E2抗體濃度,減少了血清和肝臟中的促炎細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α和MCP-1的表達(dá),并減輕了肝臟組織炎癥程度,明顯改善了小鼠PBC的嚴(yán)重程度。(4)PBC小鼠肝臟中的RIP1、RIP3、p-RIP3、MLKL、p-MLKL表達(dá)升高,抑制HSP90下調(diào)了上述分子的表達(dá)。結(jié)論:我們成功構(gòu)建了小鼠PBC模型,發(fā)現(xiàn)HSP90在PBC小鼠肝臟中的表達(dá)增高。抑制HSP90通過(guò)減輕壞死性凋亡改善了小鼠PBC病情嚴(yán)重程度。HSP90有希望成為PBC的重要治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R575.7
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié) 果功建立 PBC 動(dòng)物模型鼠肝臟 HE 染色可見(jiàn)匯管區(qū)膽管炎PBC 的早期病理學(xué)特征是匯管區(qū)以中、小膽管為中心的漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)。我們對(duì)健康對(duì)照組和 PBC 組小鼠肝臟切片行 HE 染色，發(fā)現(xiàn) PBC 小管區(qū)，尤其是受損的小葉間膽管周?chē)罅苛馨图?xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，是典型的小膽管炎，符合 PBC 的早期病理學(xué)改變。而健康對(duì)照組匯管區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及損傷，并且沒(méi)有肝臟實(shí)質(zhì)的病理改變（圖 1）。

對(duì)照組 PBC圖 2：小鼠血清抗 PDC-E2 抗體C 小鼠的肝臟中表達(dá)增高的研究表明 HSP90 在健康對(duì)照組的肝細(xì)胞中表達(dá)較弱，且精性肝病小鼠的肝細(xì)胞中表達(dá)增加[27]。為了探究 HSP90 在通過(guò)免疫組化和 Western Blot 評(píng)估了 HSP90 蛋白在 PBC 小照組小鼠肝臟石蠟切片免疫組化結(jié)果顯示正常小鼠肝細(xì)胞陽(yáng)性，與之前的研究結(jié)果相一致。PBC 組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可綠色箭頭標(biāo)識(shí)）。而且肝細(xì)胞細(xì)胞核可見(jiàn)深棕色，呈強(qiáng)陽(yáng)性膽管上皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大面積棕染（黑色箭頭標(biāo)識(shí)）（圖 3A中的表達(dá)比對(duì)照組高。同時(shí)，Western Blot 進(jìn)一步驗(yàn)證了 IH HSP90 可能與 PBC 的發(fā)病有關(guān)。

對(duì)照組及PBC組HSP90表達(dá)情況

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