【摘要】： 肝纖維化是由于細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成大于降解導(dǎo)致過度沉積,是纖維增生與纖維分解不平衡而引起的病理過程。芍藥苷(paeoniflorin,Pae)是白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP)中的主要有效成分,本課題組以往研究發(fā)現(xiàn),TGP具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗肝損傷和肝纖維化等作用。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupled receptors kinases,GRKs)是一簇與G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)快速脫敏相關(guān)的激酶,在調(diào)節(jié)GPCRs信號中起到至關(guān)重要的作用。本實驗在以往研究基礎(chǔ)上,采用豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型,首先從整體水平考察了免疫性肝纖維化過程中大鼠肝臟與肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)中G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G-protein-coupled receptors kinase 2,GRK2)表達水平的變化;體外選用HSC-T6細胞株,從細胞和分子水平探討GRK2在HSC表達的變化,以進一步探討其調(diào)節(jié)HSC G蛋白偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及抑制HSC異常增殖的作用機制,并觀察Pae對HSC GRK2表達及轉(zhuǎn)膜的影響, 目的:采用豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型,從病理形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)等方面,觀察免疫性肝纖維化大鼠肝臟及HSC中GRK2與G蛋白偶聯(lián)受體激酶3(G-protein-coupled receptors kinase 3,GRK3)的表達情況;以肝纖維化過程中的關(guān)鍵細胞HSC為突破口,觀察Pae對rhPDGF-BB刺激HSC-T6增殖的影響以及GRK2在HSC-T6增殖中的作用;探討G蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在rhPDGF-BB刺激HSC-T6增殖中的作用和G蛋白表達的改變,部分闡明GRK2在HSC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)節(jié)作用及Pae抑制HSC增殖的分子機制。 方法:Wistar大鼠腹腔注射豬血清建立免疫性肝纖維化模型,設(shè)立正常對照組(0周)、模型組(3、6、9、12、16周),采用HE染色和Masson染色對肝臟組織作病理檢查;免疫組織化學(xué)染色法、蛋白免疫印跡法檢測肝臟中GRK2與GRK3表達水平的變化。原位灌流分離肝纖維化大鼠HSC,Western blot法檢測HSC中GRK2表達水平的變化。體外以HSC-T6為模型,設(shè)立正常對照組、rhPDGF-BB(50μg·L-1)刺激組、GRK2抑制劑(62.5~1000μmol·L-1)組、Pae(10-4~10-6mol·L-1)組,采用MTT法檢測HSC增殖情況;3H-TdR法檢測HSC增殖情況;另外,設(shè)立正常對照組、rhPDGF-BB(50μg·L-1)刺激組、GRK2抑制劑(250μmol·L-1)組、Pae(10-5mol·L-1)組,采用放射性免疫法測定HSC-T6 cAMP水平;采用Western blot法檢測HSC-T6中GRK2、Gαi-1、Gαi-2、Gαs蛋白的表達水平的變化。 結(jié)果: 1.免疫性肝纖維化大鼠肝臟中GRK2與GRK3的表達情況 Wistar大鼠腹腔注射豬血清在16周時可以成功建立免疫性肝纖維化模型,在光鏡下可見中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)締組織變厚,增生的膠原纖維從匯管區(qū)延伸至小葉間,并向鄰近的肝小葉伸出纖維索,形成粗大的纖維間隔,并將增生的肝細胞團包繞分隔成大小不等的假小葉。免疫組織化學(xué)染色與Western-blot法檢測發(fā)現(xiàn)免疫性肝纖維化大鼠肝臟中GRK2與GRK3的表達較正常組明顯降低,并且伴隨造模時間的延長,表達量有下降趨勢。 2. GRK2在免疫性肝纖維化大鼠HSC中的表達 在造模第3,6,9,12,16周原位灌流法分離、培養(yǎng)大鼠HSC, Western-blot法檢測發(fā)現(xiàn),免疫性肝纖維化大鼠HSC中GRK2的表達較正常組明顯降低,并且伴隨造模時間的延長,表達量有下降趨勢。 3. GRK2抑制劑與Pae對rhPDGF-BB刺激HSC-T6增殖的影響 體外建立rhPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6增殖模型,結(jié)果表明Pae在10-4~10-6mol·L-1濃度范圍內(nèi)明顯抑制HSC-T6增殖。當加入GRK2抑制劑(5-甲基[2-(5-硝基-2-呋喃基)乙烯基]-2-糠酸酯,C12H9NO6)后,GRK2抑制劑(62.5~1000μmol·L-1)可以明顯抑制HSC-T6增殖。 4. rhPDGF-BB刺激下HSC-T6 G蛋白-AC-cAMP通路的改變 分離HSC-T6胞漿、胞膜蛋白,應(yīng)用Western-blot方法,檢測rhPDGF-BB(50μg·L-1)刺激HSC-T6中G蛋白-AC-cAMP通路的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),rhPDGF-BB可明顯促進HSC-T6胞漿蛋白中GRK2的表達升高,同時降低Gαi-1和Gαi-2的表達,但對Gαs的表達無明顯影響。而在HSC-T6胞膜蛋白中,rhPDGF-BB可明顯降低GRK2的表達,同時促進Gαi-1和Gαi-2的表達升高。但對Gαs的表達無明顯影響。同時rhPDGF-BB可以降低細胞內(nèi)cAMP水平,促進HSC-T6增殖。 5. rhPDGF-BB刺激的HSC-T6 G蛋白-AC-cAMP信號通路與GRK2的關(guān)系及Pae的作用 在rhPDGF-BB刺激的HSC-T6中加入GRK2抑制劑(終濃度250μmol·L-1)后,Western blot檢測發(fā)現(xiàn),HSC-T6胞漿蛋白中GRK2表達降低,Gαi-1和Gαi-2表達升高,而在胞膜蛋白中GRK2表達升高,Gαi-1和Gαi-2表達降低,同時Gαs的表達均無明顯改變。此外,GRK2抑制劑可以明顯提高由rhPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6 cAMP水平降低,抑制細胞增殖。而在HSC-T6中加入GRK2抑制劑(終濃度250μmol·L-1)與Pae(10-5mol·L-1)共培養(yǎng)后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSC-T6胞漿蛋白中Pae可升高GRK2抑制劑誘導(dǎo)的GRK2表達減少,同時促進了Gαi-1和Gαi-2的表達的下降,而在胞膜蛋白中Pae可降低GRK2抑制劑誘導(dǎo)的GRK2表達升高,同時促進了Gαi-1和Gαi-2的表達的增加,而Gαs的表達均無明顯改變。 結(jié)論: 1.豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化大鼠肝臟組織和HSC中GRK2表達水平隨造模時間的延長有下降趨勢,提示GRK2可能是導(dǎo)致免疫性肝纖維化大鼠HSC異常增殖的重要分子。 2.rhPDGF-BB可以明顯促進HSC-T6胞漿蛋白中GRK2的表達,降低Gαi-1和Gαi-2的表達,而在胞膜蛋白中,rhPDGF-BB降低GRK2的表達,促進Gαi-1和Gαi-2的表達。同時rhPDGF-BB可以降低細胞內(nèi)cAMP水平,促進HSC-T6增殖。提示rhPDGF-BB可能改變HSC-T6胞漿胞膜上GRK2蛋白的分布,使HSC-T6 Gαi蛋白偶聯(lián)的信號通路激活,從而刺激了HSC-T6過度增殖。 3. GRK2抑制劑可明顯抑制rhPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6胞漿蛋白中GRK2表達增加,促進Gαi-1和Gαi-2的表達的升高,而在胞膜蛋白中正好與此相反,同時可以升高細胞內(nèi)cAMP水平,而Pae可能通過改變GRK2的表達和活性,恢復(fù)了G蛋白-AC-cAMP信號通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo),從而抑制HSC-T6增殖、維持其正常功能。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.2
【圖文】：

26 1 豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠在不同時間點肝臟病理學(xué)的改變（HE 染色 ×100）ig1 Time course analysis of histopathology in rats with porcine serum induceiver fibrosis（hematoxylin and eosin stains ×100）A：Normal B：porcine serum model （3wk）C：porcine serum model（6wk） D：porcine serum model（9wk）E：porcine serum model（12wk） F：porcine serum model（16wk）

27圖 2 豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠在不同時間點肝臟病理學(xué)的改變（Masson 染色 ×100）Fig2 Time course analysis of histopathology in rats with porcine serum induliver fibrosis（Masson stain ×100）A：Normal B：porcine serum model （3wk）C：porcine serum model（6wk） D：porcine serum model（9wk）E：porcine serum model（12wk） F：porcine serum model（16wk）

28 3 豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠在不同時間點肝臟中 GRK2 表達量的變化（免疫組織化學(xué)染 ×400）ig3 Time course analysis of GRK2 expression by immunohistochemical method iats with porcine serum indeced liver fibrosis （ immunohistochemistrtaining×400）A：Normal B：porcine serum model（3wk）C：porcine serum model（6wk） D：porcine serum model（9wk）E：porcine serum model（12wk） F：porcine serum model（16wk）

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2792666