【摘要】：目的:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),是以彌漫性肝細(xì)胞肥大、泡性肝脂肪變性為病理特征的一類慢性肝病。顧名思義,NAFLD是指除酒精和其他明確的損傷肝臟的因素之外,所發(fā)生的肝臟病變。近年來,NAFLD患者的數(shù)量在逐年升高,已嚴(yán)重威脅到人類健康�！吨袊靖畏乐沃改�(科普版)》(2015版)中顯示:截止2015年,中國成年人脂肪肝患病率約為15%(6.3%-27%)。非酒精性脂肪肝與糖尿病、肥胖等代謝綜合征密切相關(guān),現(xiàn)已居全球慢性肝病的首位。生長激素(Growth hormone,GH)是一類由腦垂體所分泌的、由191個(gè)氨基酸組成的單肽鏈,通過與生長激素受體(Growth hormone receptor,GHR)結(jié)合發(fā)揮作用,是調(diào)節(jié)機(jī)體生長、發(fā)育等過程的重要內(nèi)分泌因子。在肝內(nèi),生長激素通過生長激素受體的介導(dǎo)刺激合成胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)。低水平的GH和IGF-1與NAFLD的嚴(yán)重程度相關(guān)。在肥胖的嚙齒類動物和生長激素缺乏的病人中,給予GH和IGF-1治療可以減輕脂肪肝的狀況。這些證據(jù)表明GH在肝臟脂代謝的進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本文將利用肝臟特異性敲除生長激素受體(liver-specific knockout of growth hormone receptor mice,LiGHRKO mice)8周齡雄性小鼠來討論GH/IGF-1軸與NAFLD之間的聯(lián)系。期望尋找到治療NAFLD的新藥物靶點(diǎn)。方法:1.利用Cre-Loxp雜交技術(shù),將同為C57BL/6J遺傳背景的Alb-cre和GHR~(fl/fl)小鼠雜交,同時(shí)具有Alb-cre和GHR~(fl/fl)基因的小鼠為LiGHRKO小鼠。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)對3周齡小鼠進(jìn)行基因型鑒定。繁育得到8周齡的LiGHRKO雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)組,同窩出生的GHR~(fl/fl)小鼠為對照組。2.利用PCR、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測肝臟及其他組織GHR基因的DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)行組織特異性敲除驗(yàn)證。3.取8周齡LiGHRKO雄鼠和對照組小鼠,每組8-10只,進(jìn)行體重稱量,解剖取材,各器官稱重,并對肝臟組織進(jìn)行拍照。4.內(nèi)眥取血后,全血存于1.5 ml EP管,4000 rpm,離心10min,取上清即為血清。進(jìn)行血清學(xué)檢測,檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)的含量。5.取8周齡LiGHRKO雄性小鼠和對照組小鼠的肝臟組織,進(jìn)行RNA提取,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)檢測。6.取8周齡LiGHRKO雄性小鼠和對照組小鼠的肝臟組織,進(jìn)行蛋白質(zhì)提取,通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1通路的變化情況。7.利用線粒體活性氧、線粒體膜電位以及線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)檢測LiGHRKO小鼠和對照組小鼠的線粒體功能情況。結(jié)果:1.肝臟特異性敲除生長激素受體后,8周齡LiGHRKO雄性小鼠體重及其他臟器無明顯變化,肝臟重量與體積增大,呈非酒精性脂肪肝表型。2.肝臟特異性敲除生長激素受體后,LiGHRKO雄性小鼠出現(xiàn)糖耐量減退、胰島素抵抗和糖代謝異常。3.8周齡LiGHRKO雄性小鼠的脂肪合成顯著增加,脂肪分解明顯減少。肝臟特異性敲除生長激素受體致使肝臟內(nèi)脂肪過度沉積。4.肝臟特異性敲除生長激素受體,可減少p-PI3K ~(Tyr607)、p-AKT ~(Ser273)、p-mTOR ~(Ser2448)、p-p70S6K1 ~(Ser371)的表達(dá)水平,抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。5.肝臟特異性敲除生長激素受體后,線粒體活性氧升高、膜電位降低、線粒體相關(guān)基因表達(dá)減少、線粒體結(jié)構(gòu)紊亂。結(jié)論:本研究結(jié)果證明,肝臟組織生長激素受體的缺失致使小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗、血清中VLDL、LDL、AST、ALT的水平升高。同時(shí),肝臟組織生長激素受體的缺失增加了肝臟脂肪攝取和脂肪新生。LiGHRKO小鼠的PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1信號通路傳導(dǎo)受到抑制。而PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1信號通路在肝臟組織中的抑制,會導(dǎo)致糖異生和線粒體的功能異常。我們發(fā)現(xiàn),LiGHRKO小鼠的線粒體活性氧(ROS)升高、膜電位下降(ΔΨm)、線粒體結(jié)構(gòu)與活力相關(guān)基因表達(dá)量減少,致使線粒體結(jié)構(gòu)受損,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能紊亂。本實(shí)驗(yàn)推斷,肝臟中GH/IGF-1軸損傷后抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),引發(fā)肝臟線粒體功能異常,進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂代謝異常與NAFLD病變的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575.5
【圖文】：

圖 1 非酒精性脂肪肝的疾病譜引自 Byrne CD, Targher G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology.Apr 2015;62: S47-S64.)

圖 2 NAFLD 是多系統(tǒng)代謝性疾病(引自 Byrne CD, Targher G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology.Apr 2015;62: S47-S64.)

圖 3 生長激素受體的結(jié)構(gòu)圖 Waters MJ, BrooksAJ. JAK2 activation by growth hormone and other cBiochemical Journal. 2015; 466:1-11.)分泌到血液中，再運(yùn)送到主要靶器官—肝臟，在肝臟 GHR

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2790858