【摘要】： 第一部分 瘦素在肝纖維化組織中的表達(dá)研究 目的:探討瘦素在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)及臨床意義。 方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了30例肝組織,其中10例正常肝組織和20例肝纖維花組織,了解肝組織中瘦素的表達(dá)情況。 結(jié)果:與正常肝組織相比,瘦素在肝纖維化組織中的表達(dá)顯著增加(P0.01)。肝纖維化組織中膽小管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞呈瘦素免疫反應(yīng)陽性。 結(jié)論:瘦素的異常表達(dá)與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),提示瘦素參與了肝纖維化的病理過程。 第二部分 靶向瘦素基因的siRNAs真核表達(dá)質(zhì)粒篩選平臺(tái)的建立 目的:構(gòu)建具有特異性瘦素(leptin)基因siRNA功能的表達(dá)載體,篩選有效的靶向瘦素基因的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。 方法:以leptin為目的基因,以產(chǎn)生siRNA質(zhì)粒載體psiRNA-hH1neo為表達(dá)模板,細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成7對(duì)特異的siRNAs,即siRNA278、siRNA108、siRNA97、siRNA454、siRNA146、siRNA237、ssiRNA108,其中ssiRNA108為對(duì)照siRNA。構(gòu)建能在真核細(xì)胞中表達(dá)的靶向瘦素基因的siRNAs重組質(zhì)粒,用酶切方法和測(cè)序法對(duì)重組體進(jìn)行鑒定。應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC,用MTT檢測(cè)細(xì)胞體外黏附能力。 結(jié)果:①酶切和序列測(cè)定表明,成功構(gòu)建了靶向leptin的siRNAs表達(dá)載體;②與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染外源重組質(zhì)粒的細(xì)胞,體外黏附能力受到顯著抑制,黏附抑制率在32.52%～87.82%間,在轉(zhuǎn)染psiRNA97、psiRNA108、psiRNAl46、psiRNA237、psiRNA278、psiRNA454、pssiRNA108后,細(xì)胞黏附率分別是32.52%、35.07%、69.80%、66.45%、55.45%、49.76%、87.82%。其中siRNA278、siRNA108、siRNA97、siRNA454的抑制效果較強(qiáng)。 結(jié)論:本研究構(gòu)建的leptin siRNAs表達(dá)載體中siRNA278、siRNA108、siRNA97和siRNA454有較強(qiáng)的抑制HSC的黏附力。 第三部分 靶向瘦素基因的siRNAs對(duì)肝星狀細(xì)胞生物學(xué)活性的影響 目的:研究靶向leptin基因的siRNAs在大鼠肝星狀細(xì)胞中l(wèi)eptin表達(dá)情況及對(duì)HSC生物學(xué)特性的影響。 方法:把siRNAs真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HSC細(xì)胞內(nèi),篩選穩(wěn)定細(xì)胞克隆,應(yīng)用RT-PCR、Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞儀等方法,分析靶向leptin基因的siRNAs在HSC的表達(dá)及HSC細(xì)胞的增殖和、活化和膠原的沉積來評(píng)價(jià)siRNAs對(duì)活化型肝星狀細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。 結(jié)果:靶向leptin基因的siRNAs在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)可以下調(diào)基因的表達(dá),抑制HSC的增殖、細(xì)胞的活化和膠原的沉積。 結(jié)論:靶向leptin基因的siRNAs通過抑制靶基因及下游基因的表達(dá)逆轉(zhuǎn)活化型HSC的生物學(xué)特征,因此為肝纖維化的基因治療提供一種新的方法。 第四部分 靶向leptin的siRNAs對(duì)瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等的影響 目的:檢測(cè)靶向leptin的siRNAs對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白p-STAT3和細(xì)胞因子TGFβ1的影響,初步探討siRNAs對(duì)leptin的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制等的影響。 方法:采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNAs重組質(zhì)粒,HSC細(xì)胞經(jīng)過300μg/ml G418篩選4周后收集細(xì)胞,采用RT-PCR和Western Blot和免疫組化方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的TGFβ1和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白p-STAT3的表達(dá)。 結(jié)果:與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染siRNAs后,HSC中p-STAT3、TGFβ1表達(dá)下降。 結(jié)論:p-STAT3、TGFβ1參與了leptin在肝纖維化中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);siRNAs抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于肝纖維化的治療有一定的前景。 第五部分 siRNA聯(lián)合α-干擾素抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究 目的:實(shí)驗(yàn)研究表明siRNA對(duì)肝星狀細(xì)胞有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步研究α-干擾素(alpha-interferon,α-IFN)與靶向leptin的siRNA97單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)肝星狀細(xì)胞體外活性的影響。 方法:構(gòu)建靶向leptin的siRNA97,用α-IFN和siRNA97處理HSC,通過繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)來研究其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用,ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量,PCR-ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞的端粒酶活性。 結(jié)果:與對(duì)照組相比,α-IFN和siRNA97均能明顯抑制HSC增殖(P0.05),α-IFN和siRNA97聯(lián)合應(yīng)用時(shí)抑制作用較二者單獨(dú)作用時(shí)強(qiáng)(P0.01);細(xì)胞在軟瓊脂中集落形成率明顯下降(P0.01);可降低端粒酶活性的表達(dá)(P0.05);FCM顯示細(xì)胞周期移行被阻滯于G0/G1期;細(xì)胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量明顯降低(P0.01)。 結(jié)論:siRNA97聯(lián)合α-IFN的體外抗纖維化作用比單獨(dú)應(yīng)用α-IFN和siRNA97效果好。 第六部分 奧曲肽對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣及細(xì)胞增殖的影響 目的:探討在常氧和低氧條件下奧曲肽(octreotide)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HepaticStellate Cell)胞內(nèi)游離鈣([Ca2+]i)及增殖的調(diào)節(jié)。 方法:采用鈣熒光探針(Fura-2/AM)負(fù)載培養(yǎng)的大鼠HSC,觀察常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h后octreotide對(duì)HSC的[Ca2+]i的調(diào)節(jié),同時(shí)用四唑鹽(MTT)比色法比較不同濃度的octreotide對(duì)大鼠HSC增殖的影響。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)放免分析藥盒測(cè)cAMP、cGMP濃度。 結(jié)果:與常氧條件相比,低氧條件下HSC[Ca2+]i顯著升高(P0.01),其值分別為(137.7±7.8)和(293.2±12.4)nmol/L。500、800和1000μg/L octreotide在常氧狀態(tài)下可引起HSCs的[Ca2+]i降低(P0.05),其值分別為(92.5±2.5)、(83.8±2.3)和(76.6 ±2.2)nmol/L。低氧時(shí)500、800和1000μg/L octreotide可引起HSCs的[Ca2+]i降低 (P0.01),其值分別為(204.3μ7.4)、(174.1±4.8)和(156.6±6.6)nmol/L。常氧對(duì)照 組A值(0.232±0.016)明顯低于低氧對(duì)照組(0.533±0.036),(P0.01); 經(jīng)500、 800和1000μg/L octreotide處理后,無論是常氧還是低氧狀態(tài)下A值均明顯降低 (P0.01)。低氧條件下cAMP和cGMP含量不發(fā)生改變(P0.05);無論是常氧還 是低氧狀態(tài),經(jīng)過octreotide 500μg/L處理后,cAMP和cGMP含量增高(P0.05), 而octreotide 800、1000μg/L組更高(P0.01)。 結(jié)論:缺氧可通過第二信使系統(tǒng)促進(jìn)HSC的增生,而octreotide無論常氧還是低 氧條件下劑量依賴性抑制HSCs增殖;cAMP、cGMP參與了對(duì)HSC的調(diào)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R575.2
【圖文】：

1.HE染色結(jié)果正常肝組織由有較清晰的肝小葉，肝小葉以中央靜脈為中心，四周是放射狀排列的肝細(xì)胞索和肝血竇，肝血竇內(nèi)可見枯否氏細(xì)胞，小葉間有門管區(qū)。見圖1。

圖1正常人的肝臟HExZooFig.1thenormalhumanliver圖2正常肝的leptin免疫組化ABCx200Fig.2inununohistoehemiealABCmethodoflePtininnormalliver圖3肝纖維化的leptin免疫組化ABCxZOOFig.3inununohistoehemiealABCmethod圖4肝纖維化的leptin免疫組化ABCx200Fig.4iln印unohistoehemiealABCmethodofleptininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis

圖3肝纖維化的leptin免疫組化ABCxZOOFig.3inununohistoehemiealABCmethod圖4肝纖維化的leptin免疫組化ABCx200Fig.4iln印unohistoehemiealABCmethodofleptininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis圖5肝纖維化的leptin免疫組化ABex200Fig.5immunohistoehemiealABCmethod圖6肝纖維化的leptin免疫組化ABCx200Fig.6ifnmunohistoehemiealABCmethodofleotininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2788143