【摘要】：研究背景 炎性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)尤其是潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,UC)在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,但其病因、發(fā)病機制目前仍不清楚。糖皮質(zhì)激素、柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine,SASP)是治療IBD的常規(guī)藥物,但此兩類藥物長期應(yīng)用毒副作用大,且對部分病人無效,因此開發(fā)毒副作用小而有效的治療IBD的藥物具有重要意義。羧胺三唑(carboxyamidotriazole,CAI)是一種能夠抑制細胞外鈣內(nèi)流的化合物,其在體外和體內(nèi)模型中均表現(xiàn)出一定的抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用,此外該化合物還具有抑制血管生成、花生四烯酸釋放以及激活NF-κB通路的作用。本課題組通過動物實驗已證明該藥物對急性、亞急性和慢性炎癥具有顯著的抗炎作用。為考察該藥物對UC的潛在治療作用,我們通過建立葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium salt,DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型,并施予CAI,觀察其療效,并從組織水平、細胞水平和分子水平探討CAI對這種結(jié)腸炎模型的保護作用及作用機制,為進一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。 研究方法 采用DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,觀察小鼠的體重和糞便變化,用大便性狀改變和有無便血這兩項指標(biāo)評價小鼠的癥狀。取靜脈血并將小鼠處死,制作結(jié)腸標(biāo)本,HE染色觀察結(jié)腸組織學(xué)變化,進行粘膜損害程度評分,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清、結(jié)腸勻漿和腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6水平,采用ELISA法測定血清和結(jié)腸勻漿中基質(zhì)金屬蛋白酶-2,9(matrix metalloproteinase,MMP-2,9)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor,TGFβ1)的含量。采用免疫組化方法觀察小鼠結(jié)腸中細胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)-1、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor,NF)-κB和TNF-α的表達或活化情況。檢測小鼠結(jié)腸勻漿中髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性。檢測小鼠結(jié)腸勻漿中丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。采用硝酸還原法測定小鼠結(jié)腸勻漿中一氧化氮(NO)的含量。采用Western Blot法測定小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、IκBα和磷酸化IκBα的表達情況。采用Masson's染色法觀察小鼠結(jié)腸組織中膠原沉淀的情況。 研究結(jié)果 1.3%DSS能夠成功誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,其腸道病理變化類似于人類潰瘍性結(jié)腸炎的病理改變。潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸粘膜充血、水腫、糜爛或潰瘍形成,粘膜炎癥細胞浸潤(主要為中性粒細胞)及隱窩膿腫形成。 2.CAI(20 mg/kg)對3%DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有保護作用。連續(xù)10天給予小鼠20 mg/kg的CAI后,小鼠的體重、糞便和血便情況均有不同程度的改善。大體見CAI治療組動物結(jié)腸充血、腸壁增厚明顯減輕,粘膜缺損區(qū)淺小;組織學(xué)觀察見粘膜損害累及的結(jié)腸范圍縮小,毛細血管擴張、淋巴濾泡增生、粘膜下層水腫和隱窩結(jié)構(gòu)破壞程度明顯減輕。系列濃度的CAI(5、10、20和30 mg/kg)對3%DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有劑量依賴性的保護作用。同時CAI(20 mg/kg)對2%DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎也具有治療作用。 3.與正常對照組相比,飲用DSS的小鼠血清、結(jié)腸勻漿和腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,經(jīng)CAI治療后均降低。小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量分別降低了66.75%、20.19%和26.49%,小鼠結(jié)腸勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量分別降低了55.00%、74.95%和64.33%,小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量分別降低了80.41%、13.03%和58.58%。 4.免疫組化的檢測結(jié)果顯示,潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、NF-κB p65和ICAM-1表達明顯升高,經(jīng)CAI治療后,小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、NF-κBp65和ICAM-1的表達明顯下降。 5.與正常對照組相比,飲用DSS的小鼠結(jié)腸勻漿中MPO的活性升高,給予實驗動物CAI后,MPO的活性明顯降低,下降了13.58%。 6.給予實驗動物CAI后,潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中MDA的含量顯著降低,而SOD的活性則顯著升高。與PEG400組相比,MDA的含量降低19.57%,SOD的活性升高29.14%。 7.飲用DSS的小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中NO水平升高,但經(jīng)CAI治療后顯著降低,小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中NO含量降低了24.53%。經(jīng)CAI治療后,小鼠腹腔巨噬細胞中iNOS的表達量下降。 8.CAI能夠顯著抑制DSS引起的小鼠腹腔巨噬細胞中IκBα的降解以及磷酸化IκBα含量的升高。 9.與正常對照組相比,飲用DSS的小鼠血清和結(jié)腸勻漿中MMP-2和MMP-9的含量升高,但經(jīng)CAI治療后,血清和結(jié)腸勻漿中MMP-2的含量分別下降了27.75%和47.14%;然而MMP-9的含量卻未發(fā)生明顯改變。 10.潰瘍性結(jié)腸炎小鼠經(jīng)CAI治療后,結(jié)腸勻漿中TGF-β1含量下降了52.43%。Masson's三色染色的結(jié)果顯示,CAI能夠顯著降低小鼠結(jié)腸組織中膠原纖維的沉積。 結(jié)論 CAI對DSS誘導(dǎo)的小鼠實驗性結(jié)腸炎具有預(yù)防和治療作用,且上述作用呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。CAI可顯著改善結(jié)腸炎小鼠的腹瀉和便血,減輕腸道充血和水腫及粘膜損害的范圍和程度。CAI能夠抑制NF-κB的活化,并通過清除粘膜活性氧,抑制TNF-α、IL-1β和NF-κB的激活,阻斷相互激活的正反饋通路,阻斷IL-6、IL-1β和ICAM-1的產(chǎn)生,最終表現(xiàn)為TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1低水平表達,從而減輕腸道炎性損害,改善結(jié)腸炎癥狀。CAI能夠降低模型小鼠結(jié)腸中TGF-β1的含量,進而減少病變結(jié)腸中膠原纖維的含量,最終起到延緩病變結(jié)腸纖維化的作用。綜上所述,根據(jù)我們的研究結(jié)果可以推測,CAI作為一種口服有效且副作用較少的藥物,對潰瘍性結(jié)腸炎的臨床治療具有較高的潛在應(yīng)用價值。
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R574.62

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本文編號：2787582