發(fā)布時(shí)間：2020-08-08 12:43

【摘要】： 目的意義:嚴(yán)重?zé)齻笤斐赡c粘膜血流量下降,腸粘膜組織損傷及通透性增加,使腸道屏障功能障礙,造成腸道細(xì)菌移位,引發(fā)多器官功能障礙,是導(dǎo)致傷后高代謝的重要原因。因此促進(jìn)嚴(yán)重?zé)齻竽c道修復(fù),能減輕臟器炎癥反應(yīng),防止腸源性感染,改善代謝障礙,加快創(chuàng)面愈合,是臨床救治重要措施之一。腸道作為人體最大的內(nèi)分泌器官,其自身分泌許多腸道激素對腸道結(jié)構(gòu)功能起著重要的保護(hù)作用,隨著近年來對胰高血糖素樣多肽-2(Glucagons like peptide 2,GLP-2)認(rèn)識的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其對腸道有特異性保護(hù)作用。且有廣泛臨床應(yīng)用前景。 本研究利用基因重組技術(shù)設(shè)計(jì)構(gòu)建了GLP-2原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá),初步觀察其對燒傷后大鼠腸道及腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用,利用體外細(xì)胞模型,探討GLP-2促細(xì)胞增殖的作用機(jī)制及調(diào)控因素,為今后臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 材料與方法: 1.利用pET31b(+)表達(dá)載體,對GLP-2序列進(jìn)行重組設(shè)計(jì),構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá),優(yōu)化條件后表達(dá)并進(jìn)行親和層析純化、脫鹽。溴化氰裂解后行western blot(WB)鑒定,并低溫干燥保存。 2.采用30%TBSAⅢ度燒傷大鼠模型作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?隨機(jī)分為正常對照組(N);燒傷對照組(C);重組GLP-2治療組(Gr)及化學(xué)合成GLP-2治療組(G)。檢測大鼠傷后第7天腸粘膜通透性,腸粘膜濕重與腸段及軀殼重比,腸粘膜蛋白及腸道病理形態(tài)學(xué)的變化。RT-PCR及WB檢測GLP-2R的表達(dá),利用脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GLP-2R的Caco-2/GLP-2R(+)細(xì)胞作為體外研究模型,隨機(jī)分為正常對照組(N);缺氧對照組(C);缺氧后重組GLP-2處理組(Gr)及缺氧后化學(xué)合成GLP-2處理組(G)。觀察不同GLP-2對缺氧后細(xì)胞增殖、乳酸脫氫酶及蔗糖酶活性的影響,并檢測細(xì)胞CDK4及ZO1蛋白表達(dá)的變化。 3.構(gòu)建caveolin-1/pEGFPN2質(zhì)粒及體外合成caveolin-1 siRNA后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Caco-2/GLP-2R(+)細(xì)胞,將細(xì)胞分為正常對照組(AN)、缺氧對照組(AC)、缺氧后GLP-2處理組(AG)、caveolin-1上調(diào)細(xì)胞缺氧后GLP-2處理組(CG)、caveolin-1下調(diào)細(xì)胞缺氧后GLP-2處理組(EG),檢測細(xì)胞cAMP濃度,GRK2(ser280)磷酸化蛋白變化及細(xì)胞增殖,同時(shí)應(yīng)用信號通路抑制劑觀察GLP-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo),WB檢測ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白及Akt(ser473)蛋白磷酸化表達(dá)的變化,免疫共沉淀檢測caveolin-1與GLP-2R的作用,。觀察GLP—2對缺氧后細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響以及caveolin-1對GLP-2R跨膜信號的調(diào)控 結(jié)果: 1.成功設(shè)計(jì)構(gòu)建GLP-2/pET31b(+)質(zhì)粒質(zhì)粒,測序正確;在BLR(DE3)感受態(tài)大腸桿菌種誘導(dǎo)表達(dá)最佳條件為1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h,通過親和層析純化及溴化氰裂解法獲得單體GLP-2約100mg,重組得率5mg/100ml。 2.給予重組GLP-2及合成GLP-2后,燒傷后第7天,與燒傷對照組相比,大鼠的腸粘膜通透性明顯降低,腸粘膜蛋白含量、腸粘膜與腸段重及與軀殼重之比均明顯升高(P＜0.05),而兩種GLP-2之間差異無顯著性意義(P＞0.05)。形態(tài)學(xué)觀察兩種GLP-2均能減輕燒傷后腸粘膜病理損傷。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞嚴(yán)重缺氧8h立即加入1000nM的GLP-2,24、72h后能夠明顯增加Caco-2/GLP-2R(+)細(xì)胞的細(xì)胞增殖(P＜0.05),重組GLP-2與合成GLP-2效果無明顯差別(P＞0.05)。而GLP-2處理72小時(shí)后,細(xì)胞乳酸脫氫酶及蔗糖酶活性無明顯變化(P＞0.05)。CDK4及ZO1蛋白表達(dá)較缺氧對照組增強(qiáng)。 缺氧后立即給予1000nM的GLP-2處理,24h后,缺氧對照組cAMP含量明顯降低(P＜0.01),而GLP-2處理組的cAMP卻維持在一個(gè)較高水平。CG組細(xì)胞的cAMP明顯增加,而EG組cAMP含量下調(diào)。GLP-2處理24h后,能夠明顯增加缺氧細(xì)胞的增殖(P＜0.05),在CG組細(xì)胞增殖更加明顯(P＜0.05),EG組增殖作用下降。GLP-2處理后30min,磷酸化GRK2蛋白表達(dá)較缺氧對照組增強(qiáng),無論上調(diào)或下調(diào)caveolin-1后,磷酸化GRK-2表達(dá)下降。給予不同信號通路抑制劑后發(fā)現(xiàn),MEK1/2特異性抑制劑U0126及PI3特異抑制劑LY294002能夠明顯抑制GLP-2的促增殖作用(P＜0.05),而P38特異性抑制劑SB203580卻不能抑制GLP-2促增殖作用。。缺氧后給予GLP-2能增強(qiáng)ERK信號途徑中c-Raf、MEK1/2、ERK1/2及核內(nèi)p90RSK磷酸化蛋白的表達(dá),也能增強(qiáng)PI3信號途徑中Akt磷酸化蛋白的表達(dá)。caveolin-1上調(diào)后ERK信號通路中相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)增強(qiáng)增強(qiáng),caveolin-1下調(diào)后相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)減弱。 結(jié)論: 1.構(gòu)建GLP-2原核表達(dá)載體。誘導(dǎo)表達(dá)純化,為GLP-2獲得提供了一種新的方法。 2.重組GLP-2及化學(xué)合成GLP-2能夠降低嚴(yán)重?zé)齻蟠笫竽c粘膜通透性,增加粘膜重量及蛋白含量,減輕腸粘膜的損傷程度。對Caco2/GLP-2R(+)細(xì)胞具有明顯的促增殖作用,但對細(xì)胞無明顯毒性,對蔗糖酶活性沒有明顯的影響,能夠增強(qiáng)缺氧后細(xì)胞CDK4及ZO1蛋白表達(dá),可能參與了細(xì)胞分裂及細(xì)胞間緊密連接的調(diào)控機(jī)制。 3.GLP-2對細(xì)胞的促增殖作用伴有cAMP的增加,而磷酸化GRK2蛋白負(fù)反饋機(jī)制可能參與了對cAMP的調(diào)控。GLP-2對細(xì)胞增殖的作用依賴于ERK及PI3途徑,其可以引起c-Raf,MEK1/2,ERK1/2及P90RSK磷酸化蛋白表達(dá)增強(qiáng),也使Akt磷酸化蛋白表達(dá)增強(qiáng)。而可能不依賴于P38信號途徑。Caveolin-1對GLP-2R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能有調(diào)控作用,本實(shí)驗(yàn)中,其可促進(jìn)GLP-2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及激活ERK,PI3信號途徑。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R644;R574
【圖文】：

0.050圖2一1.*-一﨑一*，一.一正常組燒傷組重組GLP一2組合成GLP一2組注:與燒傷組相比，**.P<0刀1。GLP一2對燒傷后大鼠腸粘膜通透性的影響 (FITc一 Dmg/l們，x士s) 1.2GLP一2對燒傷后大鼠粘膜濕重/腸段，濕重/軀殼重以及粘膜蛋白含量的影響:燒傷后7d，燒傷組大鼠腸粘膜與腸段重及與軀殼重之比較正常組均明顯下降(P<0.05)，腸粘膜蛋白含量也明顯減低(P<0.05)。說明燒傷后腸粘膜功能受到損傷，而給予GLP一2后7d

圖2一4.GLP一2對燒傷后大鼠腸粘膜蛋白含量的影!l向(mg/g濕重，x士s)1.3GLP一2對燒傷后大鼠腸道病理損傷的影響:正常大鼠空腸粘膜絨毛完整，致密且排列整齊(圖2一5)，燒傷后大鼠傷后第7天，腸粘膜絨毛明顯變短，脫落，排列紊亂，間質(zhì)水腫，散在較多炎細(xì)胞浸潤，基底層變薄(圖2一6)。而GLP一2組傷后7d損傷比燒傷組有所減輕，粘膜下輕度水腫，絨毛排列較為規(guī)則，長短較為一致，未見明顯的上皮脫落，基底層完整。重組GLP一2與合成GLP一2無明顯區(qū)別(圖2一7，2一8)

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本文編號：2785578