【摘要】： 目的:水通道蛋白(aquaporin,AQP)是Agre等人于1988年分離紅細(xì)胞Rh血型抗原的一段32KD多肽的過程中無意得到的一段28KD的多肽,后來被證實為介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外水轉(zhuǎn)運的通道,在微生物、植物、哺乳動物中廣泛存在,并在多種器官的生理和病理中發(fā)揮重要作用。本研究旨在通過肝素對葡萄糖誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞(human perotoneal nesothelial cells,HPMCs)對AQP1、AQP3mRNA及蛋白表達(dá)的影響。 方法:從連續(xù)不臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD)治療的慢性腎臟病患者腹膜透析流出液中分離并培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞,第二代細(xì)胞應(yīng)用免疫組化方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定,第三代細(xì)胞用于實驗,分別按照不同的實驗要求分成2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素組、2.5%葡萄糖加5×10-3mg/ml肝素組、2.5%葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組。采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction , RT-PCR)半定量分HPMCs中AQP1、AQP3mRNA的表達(dá)水平,采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HPMCs上AQP1、AQP3的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果: 一、葡萄糖及肝素誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3mRNA的影響 1、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理HPMC不同時間后檢測,結(jié)果顯示葡萄糖可顯著誘導(dǎo)間皮細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA上調(diào),并隨時間延長而增多,與無糖組比較具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異,且AQP1mRNA表達(dá)量在24小時最大(t=-53.576,P0.01)。而葡萄糖組與葡萄糖加肝素組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 2、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理HPMC不同時間后檢測,結(jié)果顯示葡萄糖可顯著誘導(dǎo)間皮細(xì)胞表達(dá)AQP3mRNA上調(diào),并隨時間延長而增多,與無糖組比較具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異,且AQP3mRNA表達(dá)量在24小時最大(t=-43.743,P0.01)。而葡萄糖組與葡萄糖加肝素組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 3、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加不同濃度的肝素(2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml、1.5×10-2mg/ml)分別處理HPMC 4小時后,檢測細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA的變化。結(jié)果顯示葡萄糖及葡萄糖加肝素組AQP1mRNA表達(dá)均高于無糖組,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),而葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組比葡萄糖組AQP1mRNA的表達(dá)量明顯增加(t=-37.676,P0.05)。 4、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加不同濃度的肝素(2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml、1.5×10-2mg/ml)分別處理HPMC 4小時后,檢測細(xì)胞表達(dá)AQP3mRNA的變化。結(jié)果顯示葡萄糖及葡萄糖加肝素組AQP3mRNA表達(dá)均高于無糖組,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),而葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組比葡萄糖組AQP3mRNA的表達(dá)量明顯增加(t=-30.578,P0.05)。 二、葡萄糖及肝素誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3的影響免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示無糖組見棕黃色顆粒主要分布在胞漿和胞膜上;與無糖組比較,葡萄糖和葡萄糖加肝素組陽性表達(dá)明顯增加,胞核上亦可見棕黃色深染顆粒,有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);AQP1蛋白表達(dá)在葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組與葡萄糖組及葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較,統(tǒng)計學(xué)分析有明顯差異(t=4.405,6.066, 4.983, P0.01); AQP3蛋白表達(dá)在葡萄糖加1.5×10~(-2)mg/ml肝素組與葡萄糖組及2.5×10~(-3)mg/ml、5×10~(-3)mg/ml肝素組比較,統(tǒng)計學(xué)分析亦有明顯差異(t=3.412,5.484,3.667,P0.01);而葡萄糖組與葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。葡萄糖組及葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素組細(xì)胞免疫組化圖片可見胞核及胞漿有空泡樣變,而葡萄糖加常規(guī)劑量肝素組無明顯空泡樣變。 結(jié)論: 1、葡萄糖和大劑量肝素均可顯著誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞上水通道蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)。常規(guī)劑量肝素對人腹膜間皮細(xì)胞上水通道蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)無明顯影響。 2、從免疫細(xì)胞化學(xué)圖片可以看出葡萄糖組和大劑量肝素加葡萄糖組體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞胞漿及胞核有明顯空泡樣變化,常規(guī)劑量肝素加葡萄糖組的間皮細(xì)胞空泡樣表現(xiàn)不明顯。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R572.2
【圖文】：

倒置相差顯微鏡下顯示，最初細(xì)胞呈多形性，星狀，多角形占多數(shù)，約10天左右細(xì)胞可達(dá)融合，融合后細(xì)胞似鵝卵石樣外觀，典型的為鋪路石樣(圖1、2)。2、免疫組化鑒定免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞角蛋白及波形蛋白抗原表達(dá)均陽性，胞漿中可見棕色顆粒，胞核中未見(圖3、4)。第Ⅷ因子相關(guān)抗原、白細(xì)胞CD45抗原表達(dá)陰性，胞漿及胞核中未見棕色顆粒(圖5、6)。據(jù)此可排除成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞。圖1 低倍鏡觀察（10×10） 圖2 高倍鏡觀察（10×40）圖3 細(xì)胞角蛋白陽性結(jié)果 圖4 細(xì)胞波形蛋白陽性結(jié)果圖5 第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性 圖6 白細(xì)胞CD45抗原陰性二、葡萄糖及肝素誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3mRNA的影響1、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理HPMC 0、2、4、8、24小時后，檢測細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA的變化。結(jié)果顯示葡萄糖可顯著誘導(dǎo)間皮細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA上調(diào)，并隨時間延長而增多，呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與無糖組比較具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，且AQP1 mRNA表達(dá)量

抗原、白細(xì)胞CD45抗原表達(dá)陰性，胞漿及胞核中未見棕色顆粒(圖5、6)。據(jù)此可排除成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞。圖1 低倍鏡觀察（10×10） 圖2 高倍鏡觀察（10×40）圖3 細(xì)胞角蛋白陽性結(jié)果 圖4 細(xì)胞波形蛋白陽性結(jié)果圖5 第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性 圖6 白細(xì)胞CD45抗原陰性二、葡萄糖及肝素誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3mRNA的影響1、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理HPMC 0、2、4、8、24小時后，檢測細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA的變化。結(jié)果顯示葡萄糖可顯著誘導(dǎo)間皮細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA上調(diào)，并隨時間延長而增多，呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與無糖組比較具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，且AQP1 mRNA表達(dá)量

2、免疫組化鑒定免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞角蛋白及波形蛋白抗原表達(dá)均陽性，胞漿中可見棕色顆粒，胞核中未見(圖3、4)。第Ⅷ因子相關(guān)抗原、白細(xì)胞CD45抗原表達(dá)陰性，胞漿及胞核中未見棕色顆粒(圖5、6)。據(jù)此可排除成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞。圖1 低倍鏡觀察（10×10） 圖2 高倍鏡觀察（10×40）圖3 細(xì)胞角蛋白陽性結(jié)果 圖4 細(xì)胞波形蛋白陽性結(jié)果圖5 第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性 圖6 白細(xì)胞CD45抗原陰性二、葡萄糖及肝素誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3mRNA的影響1、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分別處理HPMC 0、2、4、8、24小時后，檢測細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA的變化。結(jié)果顯示葡萄糖可顯著誘導(dǎo)間皮細(xì)胞表達(dá)AQP1mRNA上調(diào)，并隨時間延長而增多，呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與無糖組比較具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，且AQP1 mRNA表達(dá)量

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 邵先舫;李前;李瑩;嚴(yán)望;;AQP-3在SD大鼠正常骨骼肌中的表達(dá)[J];湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2012年12期

2 李燕;漆洪波;;水通道蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用[J];中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志(電子版);2006年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 杜娟;鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟髓質(zhì)水通道蛋白-2的表達(dá)及意義[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 李燕;地塞米松和米非司酮對人羊膜上皮細(xì)胞水通道蛋白8表達(dá)的影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2006年

2 李瑩;“治傷散”巴布劑對大鼠急性軟組織損傷中水通道蛋白-3（AQP-3）干預(yù)的實驗研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2009年

本文編號：2784012