【摘要】：研究目的腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是最常被診斷的消化道疾病。對于大多數(shù)患者而言,腸易激綜合征病程遷延,反復(fù)發(fā)作,病情隨時(shí)間的變化而變化。在IBS發(fā)生之前進(jìn)行的手術(shù)、其他疾病的發(fā)生以及同時(shí)并發(fā)的焦慮以及抑郁等心理障礙都將導(dǎo)致該疾病的預(yù)后變差,同時(shí)患病人群的生活質(zhì)量及工作效率顯著降低。在過去的40多年間,多種致病因素被發(fā)現(xiàn)參與了腸易激綜合征的發(fā)生發(fā)展。過去的傳統(tǒng)研究認(rèn)為腦-腸軸調(diào)節(jié)異常、胃腸道動力異常、內(nèi)臟感覺異常以及精神心理異常等是IBS的主要病因,但這些傳統(tǒng)研究理論只能解釋部分IBS患者的發(fā)病機(jī)制。隨著近年研究深入發(fā)現(xiàn)腸粘膜通透性增加、腸道微生態(tài)系統(tǒng)的改變、腸道免疫激活等是部分IBS患者發(fā)病的主要病理機(jī)制。臨床證據(jù)顯示,在腹瀉型腸易激整合征(IBS-D)患者中觀測到了小腸以及結(jié)腸滲透性增高。腸道屏障是維持腸上皮完整并保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)境干擾破壞的主要防御機(jī)制。對于個(gè)體而言腸道屏障的作用主要體現(xiàn)在:吸收腸內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)以及抵御外界危險(xiǎn)致病物質(zhì)滲透進(jìn)入粘膜下組織。破壞腸道上皮屏障功能在慢性炎癥性腸道疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。腸粘膜通透性的改變將導(dǎo)致腸道細(xì)菌負(fù)荷量增加,誘導(dǎo)腸粘膜固有層食物抗原刺激腸粘膜引起炎癥。正常腸道中寄居大量非致病細(xì)菌,組成腸道生物屏障,其中大部分益生菌參與維持正常腸道屏障功能,這部分益生菌的作用機(jī)制被廣泛深入研究。益生菌是一類活性微生物,當(dāng)攝取足夠量時(shí)可改善宿主(如動物或人類)腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡,并對宿主有正面效益。益生元是一類營養(yǎng)物質(zhì),通常指碳水化合物,可以促進(jìn)益生菌的生長。臨床研究通過可靠數(shù)據(jù)評估益生菌對IBS的作用,在最近的一項(xiàng)薈萃分析中包括35個(gè)隨機(jī)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),益生菌作為一類改善IBS癥狀的制劑,可以緩解腹痛,腹脹,脹氣等典型IBS癥狀(相對危險(xiǎn)度,0.79;95%CI,0.70-0.89)。隨著研究深入,益生菌發(fā)揮益生作用的多個(gè)機(jī)制被探索發(fā)覺,包括競爭性黏附上皮細(xì)胞、改善腸道微生態(tài)、增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)、保護(hù)腸上皮屏障等。在眾多益生菌中,乳酸桿菌和雙歧桿菌作為其中的優(yōu)勢菌群,被大量研究并廣泛使用,相關(guān)的食物副產(chǎn)品為越來越多人所接受。臨床相關(guān)研究指出,從健康人體分離得到的乳酸桿菌已被證實(shí)可以改善模型動物的腸道屏障功能并緩解IBS患者不適癥狀。部分基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),提高參與緊密連接信號的基因表達(dá)是維護(hù)并加強(qiáng)腸道屏障功能完整性的潛在機(jī)制,例如,乳酸桿菌參與調(diào)節(jié)T84細(xì)胞系上皮細(xì)胞間E-cadherin以及?-catenin在內(nèi)的黏附連接蛋白的基因表達(dá)。此外,使用乳酸桿菌孵育腸上皮細(xì)胞會差異性影響?zhàn)じ竭B接蛋白的磷酸化,豐富蛋白激酶C亞型含量,從而積極調(diào)節(jié)上皮屏障功能。在許多腸道疾病中,我們發(fā)現(xiàn)促炎因子水平的改變和腸道通透性之間存在密切關(guān)聯(lián),提示促炎因子通過損傷上皮細(xì)胞間連接增加細(xì)胞間通透性從而破壞腸上皮功能。在后續(xù)研究中使用益生菌作用于腸道,能有效預(yù)防細(xì)胞因子誘導(dǎo)的上皮損傷,促進(jìn)腸粘膜屏障的加固。鼠李糖乳桿菌GG是乳酸桿菌的一種,近年來被深入研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌GG抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡。針對鼠李糖乳桿菌GG隨后深入研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌能產(chǎn)生兩種特異性分泌蛋白,p40和p75,將兩者分別作用于上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可再現(xiàn)鼠李糖乳桿菌GG抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡,防止過氧化物誘導(dǎo)損傷上皮屏障。p40和p75分別通過激活PI3K/Akt信號通路和PKC-MAPK信號通路參與上皮細(xì)胞抗凋亡作用,闡明鼠李糖乳桿菌GG兩種分泌蛋白的腸道益生作用不僅能夠了解其作用機(jī)制,更為我們進(jìn)一步開發(fā)出能規(guī)避使用活體細(xì)菌治療所帶來的問題的有效藥物的戰(zhàn)略奠定基礎(chǔ)。隨著科學(xué)發(fā)展,我們發(fā)現(xiàn)使用動物(主要是嚙齒動物)建模人類疾病和人類疾病的病理生理之間存在差異,這樣的差異導(dǎo)致無法準(zhǔn)確反映相關(guān)病理生理機(jī)制,并且是臨床試驗(yàn)中藥物失效的關(guān)鍵因素之一。人類干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域的快速進(jìn)步使得人類組織體外培養(yǎng)技術(shù)日趨完善,使其成為替代動物模型應(yīng)用于科研及臨床相關(guān)領(lǐng)域的重要手段,大大減少動物模型帶來的局限性。最近科學(xué)家識別并從人體小腸上成功分離出腸上皮干細(xì)胞(Lgr5+),該腸上皮功能結(jié)構(gòu)稱為“enteroid”,該結(jié)構(gòu)缺乏肌成纖維細(xì)胞,由四種正常腸上皮細(xì)胞組成,經(jīng)體外培養(yǎng)后最終形成隱窩-絨毛分化軸結(jié)構(gòu)。該模型的成功建立將成為學(xué)習(xí)并探索全消化道干細(xì)胞功能、細(xì)胞增殖以及腸上皮細(xì)胞生理病理機(jī)制的有效平臺,同時(shí)也為本次研究成功搭建體外人體三維腸道模型奠定技術(shù)基礎(chǔ)。研究方法在此次研究中,我們通過使用三維人體enteroid模型平臺,發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌分泌上清能有效抑制伽馬干擾素誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷,該有效抑制作用不依賴于益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用。然而,存在于分泌上清中的有效成分仍然無從得知。為了進(jìn)一步探索鼠李糖乳桿菌分泌上清中的有效成分,我們將包含多種成分的上清液跑膠藍(lán)染后,將目標(biāo)鎖定在表達(dá)量最大的蛋白條帶,該條帶分子量為41.5KDa。通過基因重組技術(shù)合成該蛋白,首先運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增p40分泌蛋白基因編碼序列并將擴(kuò)增后的產(chǎn)物結(jié)合到pET28b~+質(zhì)粒表達(dá)載體。6×組氨酸被編碼入P40的N端。序列分析表明1236bp開放閱讀框架區(qū)間的存在。隨后,利用大腸桿菌菌株BL21(DE3)/pLysS大量表達(dá)該蛋白,并通過鎳nitrilotrialetic酸瓊脂和快速蛋白液相色譜法純化蛋白。被純化后的蛋白p40用于制備特異性抗體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。我們通過Western blot檢測證實(shí)p40蛋白在鼠李糖乳桿菌分泌上清中大量表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,我們將p40單獨(dú)加入enteroid系統(tǒng)中檢測p40是否能夠發(fā)揮有效作用抑制伽馬干擾素誘導(dǎo)腸上皮功能損傷。在將p40蛋白預(yù)處理enteroid 12小時(shí)后,伽馬干擾素(200ng/ml)隨后加入該系統(tǒng)共同孵育24小時(shí)。研究結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)伽馬干擾素導(dǎo)致enteroid中緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1基因表達(dá)量下調(diào),使用LGG上清液以及p40預(yù)處理后則能抑制緊密連接蛋白基因下調(diào)趨勢。同時(shí),我們通過免疫耗竭技術(shù)除去LGG分泌上清中的p40后預(yù)處理enteroid,結(jié)果顯示缺乏p40蛋白的LGG分泌上清無法緩解伽馬干擾素誘導(dǎo)的上皮功能損傷。通過免疫熒光技術(shù)顯示enteroid中緊密連接蛋白含量及蛋白分布,結(jié)果與上述基因改變一致。此外,我們運(yùn)用顯微注射法來測量enteroid上皮功能學(xué)變化,通過將熒光顯色劑FD4注入enteroid球體內(nèi),監(jiān)測FD4由內(nèi)向外滲透性變化,結(jié)果顯示伽馬干擾素加快FD4從enteroid球體內(nèi)向外的滲透性,而提前加入p40預(yù)處理組的滲透速率顯著下降,與正常對照組保持一致,缺乏p40的LGG分泌上清組滲透性較未去除組增高。提示鼠李糖乳桿菌分泌上清中的有效成分p40預(yù)處理后能有效保護(hù)緊密連接蛋白不受促炎因子損傷,抑制伽馬干擾素誘導(dǎo)人體enteroid腸上皮屏障破壞,維護(hù)正常的腸道功能。結(jié)論1.p40可溶性分泌蛋白的成功生產(chǎn)與純化。2.p40蛋白特異性抗體的成功制備。3.LGG分泌上清預(yù)防性維護(hù)伽馬干擾素誘導(dǎo)人體enteroid緊密連接基因及蛋白含量表達(dá)量,抑制緊密連接蛋白重分布,抑制伽馬干擾素誘導(dǎo)人體enteroid上皮細(xì)胞滲透性增高。4.P40預(yù)防性保護(hù)伽馬干擾素誘導(dǎo)enteroid緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1基因及蛋白含量,抑制緊密連接蛋白重分布,抑制伽馬干擾素誘導(dǎo)enteroid腸上皮屏障功能損傷。5.免疫耗竭p40后,缺乏p40的LGG分泌上清無法維護(hù)抑制伽馬干擾素誘導(dǎo)enteroid腸上皮屏障功能損傷。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R574.4
【圖文】：

在復(fù)蘇第一代時(shí)使用)。9、放回 37°C 5%CO2 孵箱進(jìn)行無菌培養(yǎng)。（六）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 PAWS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，若符合，采用單因素方差分析；若不符合，則采非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P<0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。三、結(jié)果（一）小鼠enteroids生存情況三維體外培養(yǎng)小鼠 enteroids 生存狀態(tài)：將小鼠小腸隱窩在腸粘膜分離出來鏡下觀發(fā)現(xiàn)，分離之后 6 小時(shí)開始出現(xiàn)閉合，第 3 天開始出牙，7 天之后 enteroids 大量牙，形成腸球樣結(jié)構(gòu)，圖 16 小時(shí) 第 3 天 第 7 天

四、討論

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文- 36 -圖3 注射后0小時(shí)及10小時(shí)各組enteroid內(nèi)FD4熒光變化量及FD4變化趨勢圖四、討論人體內(nèi)微生物數(shù)量龐大、種類繁多，基于不同的定植部位，微生物種類及作用各不相同。其中，定植于腸道的微生物是人體內(nèi)最大、最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，據(jù)估計(jì)，定植于人體胃腸道內(nèi)菌群將超過500種，菌群的基因總數(shù)可能是人類基因組數(shù)量1000倍，這些覆蓋在全消化道的菌群跨越腔道和粘膜層3個(gè)層面[62,63]。多種不同的腸道細(xì)

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本文編號：2782378